2024年3月，约翰霍普金斯大学吴斌团队在Nature Communications上发表了题为“A rapid inducible RNA decay system reveals fast mRNA decay in P-bodies”的文章，开发了一种RNA快速诱导突变（RIDR）技术，揭示了P小体中RNA的快速形成和降解。
RNA衰变对于维持转录本稳态和清除有缺陷的RNA至关重要。在真核细胞中，正常的mRNA降解是通过脱腺苷化或脱帽对其末端的去保护而开始的，随后是XRN1的5′- 3′降解或RNA外泌体的3′- 5′降解。含RNA的无膜细胞器，包括核斑点、应激颗粒(SGs)和加工体(P-bodies)，在RNA的剪接、修饰、储存和衰变等代谢过程中发挥着重要作用。P小体最初是在酵母中发现的，并被证明富含RNA衰变机制，但缺乏核糖体和翻译因子。因此，认为P小体是RNA衰变的位点。然而，随后的研究挑战了这一观点，因为在没有P小体时RNA降解仍然发生。最近的研究表明，P小体可能作为mRNA的储存位点，这些mRNA可以在P小体退出后再次翻译。与SGs不同，P小体存在于稳态生理条件下，将RNA招募到P小体通常需要施加胁迫，如氨基酸饥饿或渗透胁迫。在应激过程中，大量mRNA被募集到P小体中，介导应激反应和恢复。RNA衰变通常是通过在抑制转录或对新生转录本进行脉冲标记后的不同时间点收集RNA的批量实验中测量的。但是，这类方法会丢失空间信息，而且时间分辨率也受到限制。利用荧光成像实时跟踪RNA和细胞器，从而可以直接可视化亚细胞区室中的生物事件，其时间分辨率与mRNA衰变兼容。单细胞/单分子成像技术已经能够在单个等位基因水平上直接测量转录动力学。然而，由于降解的瞬态性质和信号的消失经常被成像伪影混淆，例如光漂白、散焦或视野外扩散，细胞中RNA衰变的时空动力学仍然知之甚少。mRNA在细胞中的快速扩散使得跟踪和捕捉这种不常见的、短暂的衰变过程变得具有挑战性。根据需要调节RNA的衰变将是有用的，因为它可以同步瞬时过程。虽然现有的方法，如RNA干扰，可以很方便地敲除目标基因，但需要许多小时才能发挥作用——对于研究衰变动力学来说太慢了。因此，一种诱导RNA快速和同步衰变的方法是非常需要的。利用一种化学诱导二聚化(CID)系统，通过将RNA衰变因子和序列特异性RNA结合蛋白融合到CID对来控制RNA代谢（Fig. 1a）。使用的CID对由FK506结合蛋白(FKBP)和FKBP -雷帕霉素结合域(FRB)组成，它们在低浓度雷帕霉素(Rapa)下迅速二聚化。采用诱导栓系系统，构建了一个双频载体，FRB与SMG7C融合，FKBP与HaloTag-tdMCP（特异性结合MBS基序的串联MS2外壳蛋白）融合，后者从内部核糖体进入位点（IRES）翻译，以促进共表达。将构建体命名为RNA快速诱导衰变（RIDR）（Fig. 1b）。然后将RIDR和mCherry-24x MS2结合位点（MBS）（mCherry-MBS）质粒共转染到HEK293T细胞中。流式细胞仪结果显示，Rapa诱导后，mCherry水平降低了74%（Fig. 1b，c）。这种敲除不是由于Rapa的翻译抑制，因为它依赖于tdMCP对SMG7C的束缚（Fig. 1b，c）。是位于mRNA 的5'端非编码区的一段特殊序列, 核糖体能够直接结合这段序列，从而起始mRNA的翻译。IRES允许研究人员在同一启动子的控制下共表达多个基因。使用靶向MBS区域的单分子荧光原位杂交(smFISH)探针测量了mRNA衰变的动力学。在稳定表达mCherry-MBS报告RNA和RIDR构建体的U-2骨肉瘤(U-2 OS)细胞中，Rapa诱导2小时后，约90%的mCherry-MBS RNA消失（Fig. 1d，e），这比使用mCherry siRNA处理的金标准RNA干扰快得多（Fig. 1f）。重要的是，一种非靶向内源性mRNA, hPol2RA，在有或没有Rapa的情况下衰减速率类似，证明了RIDR系统的特异性（Fig. 1g）。为了避免与新合成的mRNA混淆，在所有实验中都使用了转录抑制剂5,6-二氯-1 β -d -核糖呋喃基苯并咪唑（DRB）（Fig. 1f，g）。脱帽酶1a (DCP1a)是已知的P小体标记物。虽然P小体在稳态条件下存在（Fig. 2a），但在Rapa诱导后，ACTB-MBS mRNA仅与DCP1a共定位（Fig. 2b）。在诱导后2 h，大多数ACTB-MBS mRNA从细胞质和p小体中消失（Fig. 2c）。相比之下，在用抗ACTB的siRNA处理后，没有形成与p小体共定位的明亮RNA颗粒，尽管偶尔在p小体中发现单个ACTB-MBS mRNA（Fig. 2d，e）。阴性对照mPolR2A mRNA在任何处理下都没有在P小体中积累（Fig. 2f）。P小体数目和平均强度在处理的第一个小时内没有变化。在较长的时间尺度上，P小体数量减少，单个平均强度增加（Fig. 2g，h），这可能是由于P小体在较晚的时间点合并所致。RIDR诱导的同步募集扩增了P小体中的RNA信号，使其能够量化区室特异性衰变动力学。因此开发了一个动力学模型来描述RNA转运到P小体和随后的衰变动力学（Fig. 3a，b）。首先，P小体仅作为储存场所，内部不发生衰变(kPB = 0)。其次，P小体和细胞质的衰变速率相同(kPB = kCT)。第三，一旦mRNA进入P小体，离开的速率可以忽略不计(kL = 0)。前两个模型无法解释数据（Fig. 3c，d，f）。而第三个模型能很好地描述数据（Fig. 3e，f）。重要的是，拟合显示P小体中ACTB-MBS mRNA的衰减率高于细胞质（Fig. 3g）。总的来说，这些数据表明RNA衰变可以发生在P小体中，P小体为RNA衰变提供了动力学优势。在XRN1缺失的细胞中，在RIDR诱导后，P小体中ACTB-MBS mRNA的富集程度显著提高，并且与无序非靶向siRNA对照(NC siRNA)相比，RNA颗粒持续时间更长（Fig. 4b）。XRN1或NC siRNA处理后，对照mRNA mGAPDH在P小体中未被招募或保留（Fig. 4c）。DDX6是一种DEAD盒状RNA解旋酶，对P小体的形成至关重要、。当用siRNA敲低DDX6时，未见P小体（Fig. 4d）。RIDR处理后没有出现RNA颗粒（Fig. 4d）。ACTB-MBS mRNA在没有p小体的情况下仍然会衰变，但与NC siRNA处理相比，衰变速度较慢（Fig. 4e）。重要的是，当DDX6被敲除时，非靶向mRNA mGAPDH的衰变速率没有变化（Fig. 4f），这表明DDX6的缺失并不会减缓一般RNA的衰变。总之，这些数据表明，P小体是实现快速诱导RNA衰变所必需的。使用通常用于追踪单个mRNA的激光功率时，发现ACTB-MBS mRNA被招募到P小体中，并在Rapa诱导后持续了长达两小时（Fig. 5a）。为了验证显微镜台顶孵育环境不会干扰系统，使用可视化RNA颗粒所需的最小激发。在这种条件下， RNA颗粒在P小体中的招募和降解在一小时内，与不使用激光激发的固定细胞实验一样（Fig. 5b）。通过用不同浓度的亚砷酸钠(NaAsO2)预处理样品30min，对细胞施加人工氧化应激。在低激发条件下对诱导后的预应激细胞进行了成像（Fig. 5c）。随着NaAsO2浓度的增加，招募到P小体的mRNA持续时间更长（Fig. 5c，e）。这表明P小体内的RNA衰变动力学是可调节的，其功能依赖于环境。本研究开发了一种快速、特异性和模块化的基因编码诱导RNA衰变系统——RNA快速诱导突变（RIDR）。RIDR明显比siRNA快，将RNA的半衰期从使用siRNA的2 ~3小时缩短到使用RIDR的~30分钟。在RIDR诱导后，内源性ACTB-MBS mRNA被募集到P小体上。用数学模型和遗传扰动检查了区室化的RNA衰变。RNA衰变发生在P小体内部，并且具有更快的衰变速率。此外，P小体的功能作用是由细胞应激调节的。RIDR系统仍存在一些限制。首先，使用MBS/tdMCP系统将一个CID组分系在RNA上。目前尚不清楚SMG7C的绑定是否会导致所有mRNA的衰变，或者仅仅是MS2标记的RNA。此外，尽管CRISPR技术已经彻底改变了基因编辑，但敲入长标记仍然很麻烦。未来的改进将是用可编程的RNA结合蛋白(如rCas9)或催化死亡的CRISPR-Cas13靶向未修饰的内源性RNA。然而，需要多个结合位点才能实现SMG7C的有效敲除。因此，需要信号扩增来靶向非重复mRNAs。其次，FRB/FKBP CID系统需要雷帕霉素，一种调节mRNA翻译的mTor信号的抑制剂。本研究使用了低浓度的雷帕霉素，这样翻译就不会受到明显影响（Fig. 1c），因此RNA衰变的快速反应应该独立于mTOR信号传导。在未来，其他诱导二聚化体系，如赤霉素或光诱导二聚化剂可以用来克服这一限制。https://doi.org/10.1038/s41467-024-46943-zhttp://www.360doc.com/content/24/0101/00/83737491_1109452567.shtml
