HY5 与组蛋白脱乙酰酶 HDA15 互作抑制光形态发生中的下胚轴细胞伸长

2019年7月，Plant Physiology发表了一篇题为“HY5 interacts with the histone deacetylase HDA15 to repress hypocotyl cell elongation in photomorphogenesis”的文章，发现HY5 与 HDA15 相互作用，参与抑制下胚轴细胞伸长，从而促进光形态发生，即HY5 将 HDA15 募集到靶基因的启动子上，以光依赖性方式降低组蛋白 H4 乙酰化水平，从而抑制基因表达。

光形态发生是一个关键的植物发育过程，涉及光介导的转录组和组蛋白修饰变化。转录因子HY5作用于多个光感受器家族的下游，通过调节光响应基因的表达来促进光形态发生。然而，HY5 介导的转录调控的分子机制仍不清楚。

HDA15 与 HY5 相互作用

作者分析HDA15 是否可以与参与光形态发生的转录因子（去黄化幼苗中的 HY5 及其同源物 HYH）相互作用，进行体外和半体内pull-down试验，发现 HDA15 可以直接与 HY5 和 HYH相互作用 （图1A和B）。作者通过体内双分子荧光互补 （BiFC） 和免疫共沉淀 （Co-IP） 测定（图 1C 和 D），进一步表明 HDA15 与拟南芥中的 HY5/HYH 相互作用。

HDA15 是光形态发生中下胚轴伸长的负调节因子

在红光和远红光条件下，与野生型相比，35S：HDA15-GFP 转基因系下胚轴长度显著缩短（图 2A-D），说明 HDA15 在光形态发生中下胚轴伸长中起负作用。

作者探究 HDA15 与PHYA 和 PHYB 之间的遗传关系，发现35S：HDA15-GFP phyA 和 35S：HDA15-GFP phyB 幼苗在远红光和红光条件下与 phyA 和 phyB 突变体相比表现出更短的下胚轴（图 2A-D），又进一步测定了在红光条件下生长4天的 Col-0 和 had15-1 幼苗的细胞长度和细胞数。hda15-1 下胚轴的平均细胞长度显著长于野生型，而hda15-1 和野生型之间的细胞数量没有显著差异（图 2，E-G）。说明HDA15主要调节拟南芥幼苗的下胚轴细胞伸长。

HDA15 的酶活性是抑制下胚轴伸长所必需的

研究发现RPD3/HDA1-type HDACs, HDA5, HDA6, HDA15, 和 HDA19有组蛋白去乙酰化活性，作者想要进一步确定哪些赖氨酸（K）残基决定了HDA15乙酰化转移酶活性，通过人类去乙酰化酶HDAC1 (hsHDAC1)和HDAC8(hsHDAC8)以及拟南芥RPD3/HDA1类型的HDACs进行序列比对，候选HDA15蛋白保守位点H276, H277, D313, H315和H316进行突变为A（图 3A）。结果显示野生型 GST-HDA15 重组蛋白显示出很强的 HDAC 活性，而在保守位点突变的蛋白 HDAC 活性很低（图 3B）。相比之下，在非保守氨基酸 H282 中突变的蛋白质保持了很强的催化活性（图 3B）。

作者生成了表达 GFP 标记的 HDA15 突变体中氨基酸 （H276A、H277A、D313A、H315A 和 H316A） 突变的转基因植物。从 HDA15-GFP 转基因植物中分离的 HDA15-GFP 蛋白表现出显著强的 HDAC 活性。相比之下，HDA15-GFP 蛋白的突变型 HDAC 活性很低（图 3C）。这些数据表明 HDA15 的氨基酸 H276、H277、D313、H315 和 H316 是其酶活性所必需的。

与野生型相比，35S：HDA15-GFP 幼苗的下胚轴长度显著短，而携带突变的 HDA15-GFP 的转基因植株表现出与野生型相似的下胚轴长度（图 3、D 和 E）。综上所述，HDA15 的酶活性是抑制拟南芥幼苗下胚轴伸长所必需的。

HDA15 和 HY5 在抑制光形态发生中的下胚轴伸长中相互依赖

作者通过杂交将hy5-215等位基因引入35S：HDA15-GFP。35S：HDA15-GFP hy5 的下胚轴明显长于 35S：HDA15-GFP 的下胚轴（图 4A 和 B），表明 HDA15 在抑制下胚轴伸长中的作用部分依赖于 HY5。

35S：HY5-GFP 也通过杂交被引入 hda15 背景。35S：HY5-GFP 幼苗表现出较短的下胚轴表型。35S：HY5-GFP hda15 的下胚轴显著长于 35S：HY5 GFP hda15 （图 4C 和 D），表明 HDA15 也需要 HY5 在抑制下胚轴伸长中的作用。

作者构建了 hda15 hy5 双突变体。与 hda15和 hy5单突变体相比，hda15 hy5幼苗表现出更长的下胚轴表型（图 4E 和 F），表明 HDA15 和 HY5 在抑制下胚轴伸长方面具有加性作用。

红光条件下 HDA15 和 HY5 共调控基因的全基因组转录组分析

作者通过 RNA-seq分析了 HDA15 和 HY5 调控的转录组变化，499 个基因受 HDA15 和 HY5 共调控 （图 5A 和 B）。在这些共调控基因中，246 个基因在 hda15 和 hy5 突变体中上调，157 个基因下调（图 5A 和 B）。

通过使用DAVID对 HDA15 和 HY5 控制基因进行GO显示，HDA15 和 HY5 核心抑制基因优先与对非生物刺激的反应、对源性刺激的反应、水解酶、生殖发育、细胞壁组织和对生长素刺激的反应相关（图 5C）。相比之下，HDA15 和 HY5 诱导的基因富含铁离子结合、四吡咯结合、对氧化应激的反应和氧结合（图 5C）。这些发现表明，HDA15 可能与 HY5 一起调节去黄化幼苗的多种发育过程和途径。

HDA15 和 HY5  共抑制红光下幼苗细胞壁组织和生长素信号相关基因的表达

RT-qPCR分析证实，XTH10、XTH15、XTH17、EXP2、BXL1、PME16和PME35的表达在hda15和hy5突变体中上调（图6A），支持HDA15和HY5在下胚轴伸长中的负作用。此外，HDA15 和 HY5 还共同抑制一组与生长素信号传导相关的基因，例如IAA6、IAA19 和SAUR6、SAUR35、SAUR36 和 SAUR50（图 6A）。

hda15 和 hy5 突变体中生长素反应基因的表达增加，表明 HDA15 和 HY5 可能通过生长素信号通路抑制下胚轴伸长。与 hda15 突变体和野生型相比，细胞壁组织和生长素信号相关基因基因的转录本在 35S：HDA15-GFP 中下调（图 6B），证实了 HDA15 在抑制参与下胚轴细胞伸长的基因中的负作用。

作者进一步检测了在红光条件下生长的 35S：HY5-GFP 和 35S：HY5 GFP hda15 幼苗中细胞壁组织和生长素信号相关基因的表达水平。如图 6C 所示，细胞壁或组织化和生长素信号相关基因的表达在前者中下调，而在后者中部分或全部恢复。这些数据表明，HDA15 是抑制 HY5 调控的细胞壁组织和生长素信号相关基因所必需的。

HY5 以光依赖性方式将 HDA15 募集到细胞壁组织和生长素信号相关基因的启动子上

为了确定这些细胞壁组织和生长素信号转导相关基因是否是 HY5 在体内的直接靶标，进行染色质免疫沉淀 （ChIP） 测定，发现hy5 幼苗中 HY5-GFP 的表达可以完全恢复 hy5 突变体的下胚轴表型 （图 7A），表明 HY5-GFP 融合蛋白在体内具有功能。

当黑暗中生长 2 天的幼苗转移到红光下 3、6 和 12 小时，HY5-GFP 蛋白水平增加（图 7B）。此外，ChIP 分析表明，含有 G 盒 （CACGTG） 或含 ACGT 元件基序的 XTH10、XTH15、EXP2、IAA6、IAA19、PME16 和 SAUR36 中的启动子区域在 ProHY5：HY5-GFP 幼苗中富集（图 7C 和 D）。此外，与 HY5 蛋白水平变化一致，当黑暗生长的 ProHY5：HY5-GFP 幼苗转染红光 6 小时，HY5 与其靶标的结合显着增加（图 7D）。这说明HY5 以光依赖性方式直接结合下胚轴细胞伸长相关的基因。

并且，在 35S：HDA15-GFP 幼苗中检测到的 XTH10 、 XTH15 、 EXP2 、 IAA6 、 IAA19 、 PME16 和 SAUR36 启动子片段的富集程度与 Col-0 相比要高得多。然而， 35S：HDA15-GFP hy5 中这些启动子片段的富集与 35S：HDA15-GFP 幼苗相比显著降低（图 7E），表明 HY5 是 HDA15 与其靶基因结合所必需的。

HY5 和 HDA15 降低靶基因的组蛋白 H4 乙酰化水平

作者通过ChIP检测发现在 hda15和 hy5 幼苗中，XTH15、EXP2和IAA19这些基因的近端启动子和第一外显子区域中组蛋白 H4 乙酰化（H4ac） 水平较野生型增加（图 8A 和 B），并且在35S：HDA15-GFP 幼苗中这些靶基因的 H4ac 水平降低（图 8C）。这说明HDA15 和 HY5 可能通过降低组蛋白 H4 乙酰化水平来抑制这些靶基因的表达。

本文强调了HDA15 的酶活性是抑制拟南芥幼苗下胚轴伸长所必需的，在此基础上，发现HDA15 与 HY5 相互作用，是下胚轴伸长的负调节因子，进一步解析HY5和HDA15的共同作用机制，即HY5 将 HDA15 募集到靶基因的启动子上，以光依赖性方式降低组蛋白 H4 乙酰化水平，从而抑制基因表达。