Nature Commun |整合ATAC-seq和RNA-seq揭示番茄耐寒性调控新机制

本研究对比了冷敏感栽培番茄Ailsa Craig (AC) 和耐寒野生番茄LA1777在冷胁迫下的潜在调控机制差异。通过ATAC-Seq和RNA-Seq分析发现，冷处理后两者全基因组染色质可及性均下降，但野生番茄LA1777中染色质可及性峰值的富集比例显著高于栽培番茄AC (图1a)。通过整合ATAC-Seq和RNA-Seq数据，鉴定了18个与番茄抗寒性相关的候选基因，这些基因在抗寒野生番茄LA1777中冷处理后表达水平发生变化且染色质可及性显著不同，而在冷敏感栽培番茄AC中表达水平无变化 (图1b)。RT-qPCR验证了这些基因的表达模式，并进一步分析了这些基因冷胁迫下在野生和栽培番茄中的差异表达及染色质可及性，揭示了它们在植物抗寒反应中的多种作用。

研究关注基因启动子区域 (特别是3kb范围内) 的染色质可及性对转录活性的影响，发现转录因子WRKY34在抗寒野生番茄LA1777冷处理后，其启动子区域 (2-3kb上游) 染色质开放，而冷敏感栽培番茄AC中保持关闭。同时，WRKY34在LA1777中表达下调，蛋白积累减少，表明WRKY34可能参与调控番茄抗寒性 (图1c,d)。

图1 结合ATAC-Seq和RNA-Seq分析WRKY34在番茄低温胁迫后的表达模式和蛋白积累差异

研究比较了栽培番茄SlWRKY34和野生番茄ShWRKY34中WRKY34等位基因对冷胁迫的响应。通过病毒诱导基因沉默 (VIGS) 技术，分别在栽培番茄 (LA4024) 和携带野生番茄ShWRKY34基因的渗入系 (LA3942) 及其供体亲本 (LA1777)中沉默了相应的WRKY34基因。结果显示，携带ShWRKY34的番茄幼苗比携带SlWRKY34的幼苗具有更强的冷胁迫耐受性。沉默ShWRKY34后，番茄幼苗仍保持强耐寒性，而沉默SlWRKY34则显著提高了栽培番茄的耐寒性 (图2a-d)。

研究评估了上述番茄品系中冷响应基因CBFs和CORs的表达水平。结果显示，携带ShWRKY34的番茄品系在冷胁迫下CBFs和CORs的表达上调显著高于栽培番茄。沉默ShWRKY34后，冷响应基因表达水平与对照无显著差异，而沉默栽培番茄中的SlWRKY34则显著提高了冷响应基因的表达。这表明SlWRKY34不响应冷胁迫并负调控栽培番茄的耐寒性，而ShWRKY34在强耐寒性的野生番茄和渗入系中表达下调 (图2e)。

图2 栽培番茄和野生番茄中WRKY34等位基因响应冷胁迫的功能鉴定

通过比较六个不同番茄物种的WRKY34蛋白序列，发现其高度相似且保守。野生番茄和栽培番茄在冷胁迫下耐寒性的差异是由WRKY34s表达模式的差异而非其蛋白功能差异决定的。为探究这一差异，扩增并测序了SlWRKY34和ShWRKY34的启动子，发现野生番茄ShWRKY34启动子中存在一个60 bp的插入片段，包含W-box和GATA-box两个顺式元件 (图3a)。通过双荧光素酶转录激活实验，发现该60 bp插入片段导致ShWRKY34在冷胁迫下表达受抑制，且GATA-box在此过程中起关键作用。此外，仅包含GATA-box的30 bp插入片段也能部分抑制WRKY34的转录，表明GATA-box和整个60 bp插入片段对冷胁迫下WRKY34转录的抑制都至关重要 (图3b,c)。

为探究60 bp插入/缺失 (InDel) 是否受进化和驯化影响，分析了多种番茄品种中该InDel的变异情况。发现栽培番茄、樱桃番茄、醋栗番茄及两种野生番茄中不存在60 bp插入，但在其他野生番茄中普遍存在 (图3d,e)。进一步验证发现，携带60 bp删除的WRKY34在冷胁迫后表达无显著变化，而携带60 bp插入的WRKY34表达明显降低 (图3d)。这表明60 bp InDel与冷胁迫下WRKY34表达受抑制显著相关，且该插入在野生番茄中普遍，但在向醋栗番茄进化过程中逐渐消失。

图3 WRKY34启动子中的60 bp InDel导致WRKY34在冷胁迫下的不同表达模式

通过基因特异性Y1H实验和EMSA及微量热泳动 (MST) 等方法，发现SWIB/MDM2域蛋白SlSWIBa/b能直接结合到60 bp InDel中的SWIB-mu4 (TGATAA) 位点，该位点与GATA-box一致。同时，SlGATA29能结合到GATA-box。SlSWIBa/b与60 bp InDel的结合不仅需SWIB-mu4，还需完整的60 bp DNA片段 (图4a,b)。利用RoseTTAFoldNA预测了SlSWIBa/b与DNA结合的关键氨基酸位点，并通过突变验证发现，三个保守氨基酸(Arg6、Leu46/44、Lys88/86) 共同参与了与60 bp InDel的结合，表明SWIBs具有直接结合DNA的能力，并推测其可能形成螺旋蛋白包裹DNA，SWIB-mu4为关键识别/结合位点 (图4c-e)。

通过双荧光素酶(LUC) 实验发现，SlGATA29能抑制含有GATA-box的WRKY34启动子的LUC活性，而SlSWIBs不直接调控WRKY34表达 (图4f)。ChIP-qPCR分析显示，在含有或不含60 bp InDel的LA4024中，SlGATA29和SlSWIBb不能结合SlWRKY34启动子,但在含有60 bp InDel的LA3942中，SlGATA29在冷胁迫下能结合ShWRKY34启动子，SlSWIBb在正常温度下即可结合，冷胁迫后结合增强。在LA3942背景下过表达SlGATA29或SlSWIBb会抑制ShWRKY34在冷胁迫下的表达。比较栽培番茄和野生番茄的GATA29和SWIBs蛋白序列，发现高度同源，且均能结合WRKY34启动子的60 bp InDel片段，其中SlGATA29通过GATA-box结合，SlSWIBs通过SWIB-mu4结合 (图4g-i)。

图4 SlGATA29和SlSWIBa/b直接与WRKY34启动子的60 bp InDel结合并在冷胁迫下抑制WRKY34的表达

本研究发现，通过酵母双杂交实验，SlGATA29能与SlSWIBa和SlSWIBb在酵母中相互作用。进一步的pull-down实验、双分子荧光互补 (BiFC) 实验及共免疫沉淀 (Co-IP)实验均证实，SlGATA29在体内外均可与SlSWIBa和SlSWIBb发生相互作用 (图5a-d)。

探究SlGATA29与SlSWIBs相互作用对下游WRKY34基因表达的影响，发现含有GATA-box的WRKY34启动子LUC活性在共转染SlGATA29后显著降低，且在与SlSWIBa或SlSWIBb共转染后进一步降低，而缺少GATA盒的启动子则无此变化 (图5e)。通过体外EMSA实验及后续分析，发现SlGATA29与SlSWIBs的协同抑制作用可能与染色质可及性相关，且WRKY34启动子上的60bp InDel片段对于实现SlGATA29与SlSWIBs对WRKY34表达的协同抑制作用至关重要 (图5f,g)。

图5 SlSWIBa/b和SlGATA29协同抑制WRKY34表达

通过构建SWIBb过表达株系和CRISPR/Cas9介导的双突变体，结合ATAC-qPCR、RT-qPCR及生理指标分析，揭示了SWIBs通过影响WRKY34启动子上60bp InDel片段区域的染色质可及性，进而调控WRKY34表达和植物的抗寒性 (图6a,b)。在含有60bp InDel片段的LA3942背景下，SWIBb过表达增加染色质可及性并降低WRKY34表达，增强抗寒性,而双突变体则降低染色质可及性，不影响WRKY34表达，抗寒性减弱。在不含60bp InDel片段的LA4024背景下，SWIBs对WRKY34表达和抗寒性无影响 (图6c-e)。

通过CRISPR/Cas9技术敲除LA3942中ShWRKY34启动子的60 bp InDel片段，获得两种不同缺失的株系(图6f)。其中，缺失35 bp的株系 (Cri-60bp-2) 在冷胁迫下60 bp InDel区域的染色质可及性显著降低，WRKY34表达不再受抑制，且对冷胁迫更敏感 (图6g)。这表明60 bp InDel是受SWIB和GATA29调控的关键变异，影响WRKY34在冷胁迫下的差异表达和染色质可及性。

图6 SlSWIBa/b增强WRKY34启动子的染色质开放以提高番茄的耐冷性依赖于60 bp的InDel

WRKY34与CBF-COR冷响应途径中的SlCBF1存在相互作用，通过蛋白质互作实验 (包括C端域互作分析、GST-pull down、双分子荧光互补实验BiFC和免疫共沉淀实验Co-IP)证实了SlWRKY34与SlCBF1在核内的互作关系，但WRKY34不与SlCBF2/3或CORs互作 (图7a-d)。

为验证SlWRKY34通过与SlCBF1互作干扰其转录功能从而减弱栽培番茄抗寒性的假设，进行了EMSA和dual-LUC实验。发现SlCBF1能直接结合SlCBF1和SlCOR47启动子中的DRE元件，但随SlWRKY34蛋白浓度增加，SlCBF1结合信号逐渐减弱 (图7e)。同时，SlWRKY34与SlCBF1共转染显著抑制了SlCBF1诱导的SlCBF1和SlCOR47表达 (图7f)。此外，在slwrky34突变体中沉默SlCBF1导致抗寒性显著降低  (图7g-i)。

图7 SlWRKY34干扰SlCBF1的转录活性从而降低番茄幼苗的耐寒性

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-024-51036-y

评述：赵欢欢

编辑：赵一梅