Science|SPL13通过触发定向细胞分裂控制根尖分生组织的阶段变化

2024年11月15日，中国科学院遗传与发育生物学研究所杨宝军团队和根特大学Bert De Rybel研究组合作在Science 在线发表了题为“ SPL13 controls a root apical meristem phase change by triggering oriented cell divisions”的研究论文。该研究通过建立植物细胞分裂方向筛选系统并测试超过15000个化合物，获得了可以影响植物细胞分裂方向变化的小分子化合物coral7。进一步的研究发现coral7通过影响转录因子SPL13的表达调控细胞分裂方向。这种表达通过短根（SHR）和细胞周期调节因子导致RAM中的定向细胞分裂。从而展示了根系形态的时空变化过程及背后的分子机制。

研究背景

定向细胞分裂对决定植物的整体形态和大小至关重要，植物三维结构形成的核心是细胞分裂方向的精确控制。在这个过程中存在三种主要细胞定向分裂方式：垂轴分裂、垂周分裂和平周分裂。垂轴分裂是细胞分裂后，两个子细胞之间形成的新细胞壁与植物体的纵轴相垂直的分裂方式，促进植物体的纵向生长。垂周分裂是细胞分裂后，两个子细胞之间形成的新细胞壁与植物体的纵轴的圆周切线垂直或与半径平行的分裂方式，其不增加植物体或器官径向的细胞层次，而增加切向细胞的数量扩大圆周的长度，以适应植物体的增粗生长。平周分裂是细胞分裂后，两个子细胞之间形成的新细胞壁与植物体的纵轴的圆周切线平行或与半径垂直的分裂方式，其增加植物体或器官径向的细胞层次，使植物体增粗。

幼芽期和成虫期之间的过渡被称为营养期变化，由依赖microRNA156的SPL转录因子控制。在这一过程中发生的许多形态学变化中，定向细胞分裂使SAM的大小逐渐增加，背面出现锯齿和毛状体的现象更为突然。虽然在不同的幼体和成体发育阶段之间的过渡概念还没有被推断到根部，但在发芽后的第一周和第三周之间，细胞分裂活性的增加是非常突出的，但迄今为止尚未得到充分的研究。

科学问题

本研究旨在解决以下科学问题：

根尖分生组织（RAM）中控制定向细胞分裂过程的开始和持续时间的因素是什么？

研究结果

1. 鉴定特异性影响植物细胞分裂方向的化学物质

研究人员设计了烟草Bright Yellow-2（BY2）细胞培养系统，该系统可以在几天内以微型格式跟踪细胞分裂及其方向。为了跟踪分裂随时间的变化，在BY2细胞培养物中通过共转化核标记物产生了双色报告基因。红色代表细胞核，绿色代表质膜。该报告器允许在自动筛选平台中在2天内跟踪细胞分裂，通过这种方式，能够观察单个BY2细丝中新形成的细胞板的取向。基于该系统，对15，040个终浓度为50mM的小分子的商业文库进行了筛选，并在加入小分子后0、24和48小时记录了图像。初筛发现51种分子影响BY2细胞的细胞分裂方向。接下来，对这51个分子进行了二次筛选，在排除影响胞质分裂的分子后，观察到33个小分子对细胞分裂方向具有非常特异性的影响，但总体上不影响分裂潜能。为了确定这些分子是否能够影响植物中的细胞分裂方向，我们将携带双色报道基因系的拟南芥幼苗转移到补充有50 mM浓度的这些分子的培养基中，并在转移后24和48小时评估RAM中的细胞分裂方向。最后发现四个具有不相关的化学结构小分子coral 7、coral 8、coral 11和coral 13，能够在BY2细胞培养物中触发平周和垂周分裂，其中coral7处理导致细胞分裂方向更严格的90°转换，后续集中在coral7上进行进一步分析。

图1 基于植物细胞形态的分裂方向筛选系统及Coral7化合物效果

2. Coral7诱导RAM中SPL13的表达

研究人员发现Coral 7处理增加了RAM中的细胞数量，增加了生长素信号传导，但没有导致维管细胞定向分裂的因子，如TMO5、LOG4、PEAR等的报告细胞系的表达模式或水平产生明显变化。此外，coral7处理仍然能够重新定位高级tmo5功能丧失突变体维管细胞的细胞分裂。这些结果表明，coral 7通过一个非经典途径影响RAM中的细胞分裂方向。随后，研究团队尝试对coral7进行化学修饰以期获得其直接蛋白靶标，但是由于标记后的化合物缺乏生物学活性，研究人员进一步尝试转录组测序手段挖掘coral7可能影响的关键基因。

接下来通过批量RNA测序（RNA-seq）在时间序列实验中检查了由用coral7处理拟南芥RAM 6、12和24小时诱导的全基因组转录变化，发现SPL13在12小时时上调约100倍。之前有研究表明，在根中，SPL 9、SPL 10和miR 156均参与调控根分支和RAM长度，用coral 7处理后，sSPL 13和rSPL 13蛋白水平均被诱导，用分生组织强RPS5A启动子易位表达SPL 13，发现SPL 13表达水平的增加导致在RAM的所有细胞类型中发生垂周和/或平周分裂，导致RAM宽度显著增加，根也变得更长。这些与根相关的表型与SPL 13的相对表达水平很大程度上相关（图2 O），表明在正常发育过程中需要严格控制SPL 13的表达水平。

图2 Coral7下游基因筛选及过量表达AtSPL13可以有效改变根分生区细胞分裂方向并实现增粗

3. SPL13在RAM发育过程中的功能

为了进一步确定SPL13在RAM发育过程中的功能，研究人员分析了根在可用spl 13 -1单突变体的5DAG（发芽后5天）时的幼苗的细胞分裂相关表型。与野生型植物相比，在总体根生长或维管细胞数量方面没有观察到明显变化（图3，A、B和F）。考虑到SPL家族成员在这一发育过程中具有冗余功能。因此，分析了5 DAG spl 2 spl 9 spl 10 spl 11 spl 13 spl 15（spl hextuple或spl hext.）突变体幼苗。发现在该高阶突变体或所有miR 156敏感性SPL转录物均受到抑制的miR 156过表达系中，与野生型Col-0植物相比，当定量RAM中的几个表型特征时，在5 DAG时也未观察到显著变化（图3，C、D和F）。猜测这可能是由于miR 156水平在该发育阶段较高。于是在5个DAGRAM中分析4种不同型miR 156的时空表达模式。发现不同的miR 156同种型表现出组织特异性表达，并且表达水平均随时间降低。此外，miRNA的移动性可能会使精确的表达结构域对其功能的最终位置不那么具有决定性。为了知道SPL 13蛋白本身是否也可能是移动的，从多个组织特异性启动子驱动SPL 13。在所有的细胞系中，观察到SPL 13蛋白存在于启动子有活性的细胞附近，这表明SPL 13蛋白在细胞间是移动的。考虑到重叠的表达模式和细胞间的迁移性，这些结果意味着miR 156亚型和SPLs之间复杂的空间相互作用最终将决定SPL 13在RAM中特定位置的表达水平。在该过程中，SPL 13（图3，G至J）和其他miR 156敏感性SPL报告基因的水平随时间增加，并在20 DAG时变得强烈表达。在这个过程种分生组织长度及各细胞数量呈现出同步变化。而在spl 13 -1单突变体、spl六重突变体和miR 156过表达系在20 DAG时的成熟RAM，并与野生型Col-0对照和SPL 13错表达系进行了比较。与野生型情况相反，spl六重突变体和miR 156过表达系未显示出任何上述表征幼年期至成体转变的特征（图3，U至Y）。事实上，与Col-0对照系中观察到的5 DAG相比，spl六重突变体和miR 156过表达系中的细胞数量在20 DAG时未显示出强烈增加（图3，F和U，以及图S15 B）。这表明，SPL因子是RAM中从幼年到成年的过渡所必需的。过表达SPL 13的表达系中SPL蛋白的相对量进一步增加了与幼年期至成体过渡相关的特征，导致在任何分析时间点甚至更多的细胞和分生组织大小的总体增加（图3，E、F、U和Z，以及图S15）。表明SPL通过精确的时空表达来控制细胞分裂方向以实现根系增粗。对SPL13下游基因的分析发现其可以有效激活细胞分裂相关基因CYCB1及内皮层细胞分裂方向基因CYCD6;1的表达，并依赖于SHR途径。

图3. AtSPLs在拟南芥根系增粗中发挥了关键作用

4. SPL是植物保守的根系形态（粗度）重塑基因

通过对单子叶植物水稻及相关spl突变体的分析，同样发现SPL在水稻的根分生区细胞分裂方向及根系增粗中的关键作用，表明SPL是植物保守的根系形态（粗度）重塑基因。

图4.  OsSPLs在水稻根系的增粗过程发挥了关键作用

研究结论

本研究通过根阶段变化通过表型（出现中皮层）和分子（miR156和SPL13的相对水平的变化）特征来分型，揭示了SPL分子模块参与根系的时空形态重塑。小分子coral7能够诱导SPL13表达水平，调节SPL水平允许从发育时间中断实际时间，从而触发RAM的快速老化或延长青春。