2024年9月，来自南京农业大学园艺学院萝卜遗传育种王燕团队在《The Plant Journal》发表了题为“Exploring an economic and highly effcient genetic transformation and genome-editing system for radish through developmental regulators and visible reporter”的研究型文章，该文章报道了一种将发育调控因子与可视化报告基因相结合构建了简单、高效稳定的萝卜遗传转化和基因编辑技术。
研究背景
萝卜（Raphanus sativus）是世界上最重要的块根蔬菜作物之一，但是由于其茎再生效率不高以及对根癌农杆菌具有低易感性，导致遗传转化效率极低，基因功能研究与种质创新仍面临着巨大的挑战。
研究结果
一种基于甜菜红素的视觉报告系统，用于监测转基因萝卜毛状根
为了探索有效的可视化报告系统以监测转化过程，引入了包含甜菜红素合成所有关键基因的RUBY系统，用于阳性毛状根的鉴定（图 1a）。将35S启动子更换成MAS启动子,来提高萝卜中转基因毛状根的转化效率（图 1c）。
转基因毛状根再生植株的转化体系
尽管从转基因毛状根诱导出愈伤组织的比例较高，但在不同激素浓度的芽诱导培养基中均未观察到再生芽，因此萝卜的根-芽转化系统仍然是获得完整转基因植株的障碍（图 1d）。
图1 RUBY在萝卜中是一种有效的可见报告基因
利用转化发育调节基因可直接诱导芽的产生
通过两种有效的发育调节基因（DRs），包括玉米的Wus2和ipt基因，以及它们的组合Wus2-ipt（通过“自剪切”P2A肽连接），来测试它们能否在萝卜中诱导新生芽器官的发生并提高转化效率。在强重组型启动子35S的作用下，将携带特定发育调节基因的重组质粒导入发根根瘤菌中，再利用农杆菌介导法转到无根的萝卜幼苗中（图 2a）。结果表明，单独转化Wus2或ipt可以极大地促进萝卜伤口部位的细胞增殖和愈伤组织的形成（图2b，c）。而转化发育调节基因组合Wus2-ipt，不仅促进了伤口位愈伤组织的发育，还直接从侵染过的组织中诱导出类似芽的生长（图2d）。
图2 过表达萝卜发育调控因子（DRs）诱导的芽再生和转化。
Wus
2-ipt-RUBY系统大大提高了萝卜的转化效率
图3 过表达Wus 2-ipt-RUBY促进萝卜的芽再生和遗传转化效率。
图4 对Wus2-ipt-RUBY转基因植株中花朵形成、可育萝卜后代以及种子生产的形态学观察。
Wus 2-ipt-RUBY促进萝卜的CRISPR/Cas9靶向高频基因编辑
基于Wus2-ipt-RUBY遗传转化系统，将靶向类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶基因——八氢番茄红素去饱和酶（PDS）敲除。在发根根瘤菌MSU440的介导下，两个sgRNA位点被转入萝卜中（图 5a），RsPDS基因表达的破坏导致植物因叶绿素光合成途径受阻而呈现白化表型。研究者转化了约200个外植体，其中六株植物产生白化表型，这表明基因编辑效率为3.00%（图 5b）。通过PCR和Sanger一代测序，检测RsPDS基因的靶序列中两个sgRNA位点以及六株白化植株的突变类型，并鉴定靶位点的突变情况（图 5c,d）。随机选取了70个克隆进行测序，结果所有克隆均在靶位点2处呈现突变，而靶位点1处则未检测到突变（图 5e,f）。在观察到的突变中，频率为48.57%的1个碱基T插入和频率为38.57%的2个碱基AC缺失是最常见的突变类型，这两种突变的总频率达到了87.14%（图 5e,f）。这些结果表明，在萝卜中已成功建立了基于Wus2-ipt-RUBY系统的CRISPR/Cas9介导的高效基因编辑工具。
图 5 Wus 2-ipt-RUBY促进了CRISPR/Cas9介导的RsPDS基因组编辑。
评述
该研究成功建立了一种利用发育调控因子和可视化报告基因构建萝卜高效遗传转化和基因编辑系统。该系统在萝卜中实现了高效稳定的转化。为未来萝卜的基因功能研究和改良重要农艺性状提供了可靠的手段。并且为萝卜等一些蔬菜作物的功能基因组学、基因编辑以及物种改良的相关研究奠定基础，这同时也为后续研究一些难以进行遗传转化和基因编辑的植物物种提供了重要的参考。
原文链接：https://doi.10.1111/tpj.17068
完
评述：李京京
编辑：赵一梅
林木科学评论
