2024年10月，荷兰瓦赫宁根大学Marian Bemer团队在Nucleic Acids Research期刊上发表了一篇题为“Uncoupling FRUITFULL’s functions through modification of a protein motif identified by co-ortholog analysis”的研究论文，揭示了决定MADS-box转录因子FUL互作能力的关键位点，进而发现一个决定MADS-box转录因子相互作用特异性的关键氨基酸基序。
研
究
背
景
植物中的转录因子常在不同组织中与不同对象互作并行使多样化的功能，且彼此间存在各种功能冗余或特异，这种情况在MADS等大型转录因子家族中非常普遍。但多功能的耦合在某些情况下会限制植物进化和植物育种。剖析多功能蛋白负责特定相互作用的氨基酸基序可以调节其形成的复合体类型，进而调控其特异的功能，然而寻找到这些氨基酸基序并不容易。研究者认为借助发生亚功能化的蛋白能辅助这些氨基酸基序的解析，因此以MADS家族的FUL为例进行了研究。
研
究
内
容
拟南芥FUL通过与不同蛋白质聚合来发挥其多种功能
拟南芥FUL可在花序分生组织与SOC1结合，在果实中与AG及SEP1-3结合。为了确定FUL在这些组织中最主要的蛋白聚合体形式，研究者进行了EMSA实验。将含有CArG-box的探针与FUL/SOC1组合或FUL/AG/SEP3组合后发现，FUL、SOC1同时存在时倾向于形成异源四聚体，FUL、SEP3和AG倾向于形成FUL-AG二聚体和FUL-SEP3-AG-SEP3四聚体（图1A-1C），研究者认为这些是与目标基因结合发挥功能的主要形式。
研究者又将FUL-FLAG蛋白与SOC1聚合或与AG、SEP3聚合并进行DAP-seq检测，分别检测到4170和3887个结合靶标（p＜0.05）（图1D）。尽管两组有2231个共有靶标，但也存在明显的差异（图1E、1F）。基于所有靶标计算出的两组位置权重矩阵（PWM）区别不大，但使用差异最大的前100个位点计算后，两组蛋白的PWM有明显区别（图1G、1H），进行EMSA确认后发现FUL-SOC1和FUL-AG-SEP复合体的确有不同的结合偏好（图1I-1K）。
总之，研究者认为，拟南芥FUL可能通过与不同的MADS蛋白形成复合物获得不同的CArG-box motif结合能力，进而调控不同靶标，在多组织中发挥其各异的功能。
图1 FUL通过形成调节不同靶基因集的不同复合体来执行其多种功能
番茄FUL类蛋白的相互作用模式和功能不同
番茄共有4个FUL类蛋白，通过Y2H检测其与拟南芥FUL的互作对象能否还发生蛋白互作，发现这4个FUL类蛋白能互作的对象有很大差异，番茄FUL2能与AG、SEP3、SOC1等广泛互作，而FUL1\MBP20等较拟南芥FUL发生了分化，互作物仅限于SOC1等个别蛋白（图2A）。此外还关注到，番茄FUL类蛋白不会在Y2H实验中形成同源二聚体。在拟南芥中FUL-SOC1主要影响成花，而FUL-AG-SEP影响果实发育。因此研究者结合互作检测推测，番茄FUL2可以在拟南芥中基本实现这些功能，而FUL1\MBP20只能影响成花，转化拟南芥后发现的确如此（图2B、2C）。
研究者注意到拟南芥FUL几乎完全回复了突变体的果实表型，而番茄FUL2只能部分回复，因此又推测，这可能是由于拟南芥FUL能够同源二聚，而番茄FUL2不能（图2D）。于是又对FUL-FUL蛋白复合体进行DAP-seq检测，发现其存在537个不与FUL-SOC1/FUL-AG-SEP明显结合的靶点，并且这其中包含影响心皮和雌蕊发育相关基因HEC3（图2E、2F）。研究者进一步分析了HEC3结合峰的CArG-box基序，发现不是典型的CArGbox（CC[A/T]6GG），而是CC[A/T]6CG或CC[A/T]6GC（图2G）。
总之以上研究发现，不同的FUL蛋白复合体通过识别不同的CArG-box基序进行有差异的功能调控，因此研究者认为，如果调整FUL的氨基酸序列使FUL-FUL/FUL-AG-SEP不能互作，只保留FUL-SOC1互作，就可能解除FUL调节成花和结果的功能耦合。
图2 番茄中FUL类蛋白的蛋白互作模式不同，其对拟南芥果实发育有不同影响
番茄FUL1丧失与TAG1/AG的互作是由两个氨基酸改变导致的
番茄FUL1和FUL2序列高度相似，便于寻找控制二者形成不同复合体的特定位点，因此研究者以这两个蛋白开展后续探索。已有报道认为MIKC型MADS-box蛋白的I结构域对其蛋白互作的特异性至关重要，因此研究者将FUL1和FUL2的I结构域完全互换或者部分片段互换，通过Y2H检测其与TM3、TM29和TAG1互作能力（这三者是拟南芥SOC1、SEP3和AG在番茄中的同源蛋白），发现第58、59位氨基酸控制了二者能否与TAG1互作（图3A-3C），此处氨基酸为ST能互作，而AN不能互作，EMSA实验也支持这一结论（图3D）。
研究者将拟南芥FUL此处替换为AN，发现FUL只能与SOC1互作，不再与AG/SEP互作（图3E、3F）。进一步分别突变这两个氨基酸还发现Thr59影响了能否与AG互作，而Ser58则影响了互作强弱（图3G、3H）。
Thr和Ser让研究者联想到其与磷酸化的关系，因此研究者还将59位突变出模拟磷酸化（突变为D），但这种突变使其丧失互作能力，这排除了磷酸化主导的可能性（图3H、3I）。
图3 番茄FUL1中两个氨基酸位点影响了其与TAG1/AG互作
丧失与AG/SEP互作能力的确会影响FUL调控果实发育的功能
将pFUL:FUL(AN):tFUL、pFUL:FUL1(ST):tFUL和 pFUL:FUL2(AN):tFUL分别转化ful-7突变体，分析表型和表达水平后发现结果总体符合预期（图4）。
图4 FUL、FUL1和FUL2的互作能力影响其功能
鉴定到的位点对MADS蛋白的互作特异性至关重要
本次鉴定到影响FUL互作的Ser58Thr59/Ala58Asn59位于M结构域和I结构域边界处，此前也已有研究认为该区域与MADS-MADS二聚化的特异性相关。研究者想通过分析不同物种I结构域的保守或特异基序来评估这一区域对互作特异性是否存在普遍影响。因此，研究者收集1006个物种的11966个MIKC型MADS蛋白序列提取I结构域进行基序分析并确定了18个基序，发现I结构域中最丰富的基序就从58-59位氨基酸起始（图5A）。不过用Alphafold2预测FUL、AG、SEP3、FUL1、FUL2、TAG1和TM3的各种同源和异源二聚体，发现第58-59位不会在二聚化界面与伙伴单体直接接触（图5B）。
分析I结构域的蛋白结构后研究者认为，58-62位形成的环区、Tyr70和Met63这三部分是影响MIKC蛋白聚合特异性的主要因素，因此又选择了具有不同环区残基和互作能力的三组对象AGL16/ANR1、AGL16/AGL13和SEP3/SEP4进行交换氨基酸，发现交换氨基酸的确在一定程度上使其互作能力交换了（图5C、5D）。突变SOC1的环区、Tyr70和Met63进行Y2H实验结果也支持上述猜测（图5E）。
图5 鉴定到的位点广泛影响MADS蛋白的互作特异性
评
述
该研究从拟南芥和番茄中的FUL类蛋白出发，成功确定影响FUL蛋白互作的关键氨基酸位点，并进一步鉴定出广泛影响MIKC蛋白互作特异性的基序，以此表明借助亚功能化蛋白进行研究的优势。植物育种中常出现由一个转录因子关联多功能，进而导致非理想的多效表型耦合的限制。该研究这种寻找重要氨基酸基序进而对功能解耦合的的思路也很值得其他植物育种参考。
原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkae963
END
评述：李凤仪
编辑：何宇飞
林木科学评论
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