International Journal of Nanomedicine|淫羊藿苷通过调节破骨和成骨细胞通讯修复感染骨缺损

背景：由于破骨细胞 （OC） 和成骨细胞 （OB） 的不平衡，感染的骨缺损是一个具有挑战性的临床问题。外泌体对于骨修复中 OC 和 OB 的细胞间信号传导至关重要。淫羊藿苷已被证明可以调节 OC 和 OB 之间的平衡。然而，淫羊藿苷影响破骨细胞衍生的外泌体并随后影响成骨细胞活性的具体机制仍不清楚。本研究旨在探讨淫羊藿苷处理的破骨细胞衍生外泌体 （ICA-OC-Exo） 对感染性骨缺损病例中成骨细胞功能和骨修复的影响。
方法：本研究使用透射电子显微镜研究了破骨细胞中多泡体 （MVB） 的外泌体谱和定位以及腔内囊泡 （ILV） 的定量。通过免疫荧光染色和 Western blot 测定与外泌体释放相关的 Rab27A 和 MITF 的表达。通过 miRNA 测序进行外泌体 miRNA 表达分析。使用 RT-qPCR 、 Western blot、碱性磷酸酶染色测定 ICA-OC-Exo 对成骨细胞分化的影响。此外，将 ICA-OC-Exo 注入感染骨大鼠模型的局部骨缺损中，并使用 Micro-CT 评估骨形成。
结果：淫羊藿苷通过调节 MITF/Rab27A 信号通路增加了细胞质中 MVB 的存在，导致与 OC-Exo 相比，ICA-OC-Exo 的数量更高。此外，与 OC-Exo 相比，ICA-OC-Exo 中的 miR-331-3p 表达升高。观察到 ICA-OC-Exo 通过靶向 FGF23、减少 DKK1 并随后上调 ALP 来刺激成骨细胞功能。在体内研究中，ICA-OC-Exo 表现出在抗感染治疗后增强局部骨缺损部位骨愈合的能力。
结论：淫羊藿苷增强 OC-Exo 的定量和 OC-Exo 中 miRNA-331-3p 的表达，通过激活 miRNA-331-3p/FGF23/DKK1 通路调节成骨细胞功能。ICA-OC-Exo 在感染性骨缺损的骨修复中显示出潜在的临床适用性。

图2 淫羊藿苷调节破骨细胞中的 MITF/Rab27A。（A） 淫羊藿苷和 MITF 之间的分子对接。在 3D 图中，蓝色实线代表氢键，灰色虚线代表疏水力，在 2D 图中，粉红色实线代表疏水力，绿色和浅绿色虚线都代表氢键。（B） MITF 免疫荧光染色的代表性图像（绿色）。细胞核用 DAPI 染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。（C） 直方图表示每组中 MITF 的相对阳性表达。（D） Rab27A 免疫荧光染色的代表性图像（绿色）。细胞核用 DAPI 染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。（E） Rab27A 和细胞骨架的共定位 Pearson 相关系数 （PCC）。每个点代表显微镜下每个视图的 PCC，平均值用黑色虚线表示。（F 和 G） Western Blot 用于检测与对照组相比，淫羊藿苷处理破骨细胞中 MITF 和 Rab27A 的蛋白表达。

图3 OC-Exo 中 OC-Exo 和 miRNA 的表征和综合分析。（A） 用对照培养基和含淫羊藿苷的培养基处理的提取程序 OC-Exo 和 ICA-OC-Exo 的流程图。（B） 通过透射电子显微镜观察来自破骨细胞培养培养基的外泌体，柱：100 nm（上）。通过纳米颗粒跟踪分析确定外泌体的大小和浓度（下）。（C） 通过 Western Blot 分析鉴定外泌体的阳性和阴性标志物。（D） 与对照组相比，在 PBS 中超速离心和重悬后测量 OC-Exo 和 ICA-OC-Exo 中的总蛋白浓度。（E） OC-Exo 和 ICA-OC-Exo 中 DEmiRNAs 的聚类热图。（F） 与对照组相比，用对照细胞培养基和含淫羊藿苷的培养基处理破骨细胞和 OC-Exo 的破骨细胞和 OC-Exo 中的相对 miRNA-331-3p 表达。

图4 ICA-OC-exo 促进成骨细胞的增殖。（A） 共共培养 OC-Exo 或 ICA-OC-Exo 与成骨细胞的示意图。（B） OC-Exo 穿透成骨细胞的免疫荧光染色的代表性图像。OC-Exos 用 PKH76 （绿色） 染色，成骨细胞核用 DAPI 染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。（C） RT-qPCR 检测成骨细胞中 miRNA-331-3p 、 FGF23 、 DKK1 和 ALP 的基因表达。（D 和 E） Western Blot 检测成骨细胞中 FGF23 、 DKK1 和 ALP 的蛋白表达。（F 和 G） ALP 染色和 ALP 活性测定 OC-Exo 和 ICA-OC-Exo 对成骨细胞增殖的影响。

图5 ICA-OC-Exo 促进 miRNA-331-3p 抑制剂诱导的成骨细胞的增殖。（A） 转染 miNRA-331-3p 抑制剂的 OC-Exo 或 ICA-OC-Exo 与成骨细胞共共培养的示意图。（B） RT-qPCR 检测成骨细胞中 miRNA-331-3p 、 FGF23 、 DKK1 和 ALP 的基因表达。（C 和 D） Western Blot 检测成骨细胞中 FGF23 、 DKK1 和 ALP 的蛋白表达。

图6 ICA-OC-Exo 改善了感染骨不连大鼠模型的骨微结构。（A）感染骨不连大鼠模型上的 ICA-OC-Exo 图。（B）大鼠骨缺损的出现，以及每个治疗组在 3 周和 6 周时间点的胫骨三维重建。蓝色圆圈表示感兴趣区域（ROI，2 mm 直径）。（C） 显微 CT 获得的组织形态学参数包括 3 周和 6 周时间点的骨体积分数 （BV/TV） 、骨密度 （BMD）。

图7 ICA-OC-Exo 对感染骨不连大鼠模型中 OCN 和 FGF23 表达的影响。（A） 免疫荧光图像描绘了每组中的骨组织，在 3 周和 6 周的时间点，靶向 FGF23（红色）和 OCN（绿色）的抗体以及 DAPI 染色的细胞核（蓝色）。（比例尺：100 μm）。（B） 定量分析显示，在 3 周和 6 周的时间点，OCN 阳性细胞显著增加，FGF23 阳性成骨细胞减少。

结论

目前研究表明，淫羊藿苷通过 MITF/RAB27A 依赖性途径促进破骨细胞外泌体的分泌，并在淫羊藿苷诱导的 OC-Exo 中上调 miRNA-331-3p。ICA-OC-Exo 随后影响成骨细胞的活性。这些结果提出了一种潜在的机制，即淫羊藿苷有助于骨感染抗感染治疗后的骨再生，表明 ICA-OC-Exo 作为解决骨缺陷的创新治疗策略的潜在效用。此外，计划对 ICA-OC-Exo 的代谢和分布进行全面的体内研究，以及评估与其使用相关的长期影响，以备将来实施。