Journal of Controlled Release|一种pH值和谷胱甘肽响应性纳米中药递送系统—用于增强结肠癌免疫治疗

双氢青蒿素 （DHA） 是一种从中药青蒿中提取的化合物，已显示出作为结肠癌临床治疗策略的前景。然而，其低水溶性和生物利用度阻碍了其临床应用。已经开发了一种 pH/谷胱甘肽 （GSH） 双响应纳米中药递送系统 （PMDC NPs），用于靶向递送 DHA，并伴有丰富的一氧化碳 （CO） 释放。由于 pHCT74 肽与结肠癌细胞上过表达的 α-烯醇化酶结合介导的被动增强渗透性和保留 （EPR） 效应和主动靶向，pHCT74/MOF-5@DHA&CORM-401 纳米颗粒 （PMDC NPs） 表现出对结肠癌细胞的特异性靶向能力。一旦到达肿瘤部位，金属有机框架 5 （MOF-5） 的 pH/GSH 双反应行为使包括 DHA 和 CORM-401 在内的货物能够在酸性肿瘤微环境中快速释放。随后，DHA 刺激 CORM-401 释放 CO，从而促进 ROS 诱导的铁死亡和细胞凋亡，导致免疫原性细胞死亡 （ICD） 和通过释放肿瘤相关抗原 （TAA） 和损伤相关分子模式 （DAMP） 产生持续的抗肿瘤反应。总体而言，PMDC NPs 提高了 DHA 的生物利用度，并在体外和体内均表现出出色的治疗效果，表明它们在结肠癌的临床管理中具有作为免疫疗法和气体疗法协同治疗的有前途且可行的替代方案的潜力。

图1  PMDC NPs 的制备和表征。(A-C) (A) MOF-5、(B) MDC NPs 和 (C) PMDC NPs 的 TEM 图像。比例尺：100 纳米。(D) MOF5、MDC NPs 和 PMDC NPs 的 Zeta 电位（n = 3）。(E) PMDC NPs 的元素图谱，包括亮场、C、O、Zn、Mn、S、F、Na、Al 和 Si。刻度：200 纳米。(F) PMDC NPs 的 EDS 光谱。(G) PMDC NPs 的 DLS 尺寸分布和廷德尔效应。(H) pHCT74、CORM-401、DHA 和 PMDC NPs 的紫外可见吸收光谱。(I) MOF-5、CORM-401、DHA 和 MDC NPs 的傅立叶变换红外光谱。(J) PMDC NPs 在 H2O 中一周内的粒径变化（n = 3）。(K，L）DHA（K）和 CORM-401（L）在 pH 值为 5.0 和 7.4 时的释放行为（n = 3）。(M，N）DHA（M）和 CORM-401（N）在不同浓度 GSH 下的释放行为（n = 3）。(O）体外 PMDC NPs 的 GSH 消耗。

图2 PMDC NPs 的体外细胞摄取和细胞毒性。(A、B）荧光成像（A）和流式细胞仪分析（B）用于评估 PMDC NPs 在 CT26 细胞中的摄取行为。尺度条：50 μm。(C、D）通过荧光显微镜（C）和流式细胞仪分析（D）获得的图像描述了 pHCT74 + pHCT74/MOF-5@IR780 NPs（细胞事先用 pHCT74 处理 4 小时）、MOF-5@IR780 NPs 和 pHCT74/MOF5@IR780 NPs 在 CT26 细胞中孵育 4 小时后的细胞吸收情况。缩放条：50 μm。(E，F）用 MOF-5、CORM-401、DHA、MDC NPs 和 PMDC NPs 处理 CT26（E）和 RKO（F）细胞的细胞活力（n = 3，双向方差分析）。(G）用不同浓度的 PMDC NPs 处理 293 T 和 LO2 细胞后的存活率（n = 3，双向方差分析）。(H-J）对 CT26 和 RKO 细胞进行不同处理，以评估集落形成，并使用代表性图像进行定量分析（n = 3）。(K、L）CT26 细胞与 MOF-5、CORM-401、DHA、MDC NPs 和 PMDC NPs 共同培养的荧光显微镜图像（K）和定量分析（L）（n = 3，单因素方差分析）。缩放条：50 μm。(M，N）不同处理后 CT26（M）和 RKO（N）细胞的 LDH 检测（n = 3，单因素方差分析）

图 3 PMDC NPs 促进结肠癌细胞凋亡。(A-C）使用荧光成像（A）、流式细胞术（B）和流式细胞术统计分析（C）评估不同处理（n = 3，单因素方差分析）后 CT26 细胞中的 ROS 水平。比例尺：50 μm。(D-F）以 COP-1 + PdCl2 为探针，采用荧光成像（D）、流式细胞仪分析（E）和流式细胞仪统计分析（F）来测量 CT26 细胞内的 CO 水平（n = 3，单因素方差分析）。缩放条：50 μm。(G、H）荧光成像（G）和流式细胞仪分析（H）用于确定不同处理后 CT26 细胞的线粒体膜电位。标尺条：50 μm。(I-K）流式细胞仪（I）和流式细胞仪统计分析 CT26（J）和 RKO（K）细胞在不同处理后使用 annexin V-FITC/PI 染色的凋亡情况（n = 3，单因素方差分析）。(L）不同处理后 CT26 细胞凋亡标记物的 Western 印迹分析。(M、N）与 PMDC NPs 一起孵育的 CT26（M）和 RKO（N）细胞中，有无 10 μM NAC（一种有效的 ROS 抑制剂）的特定组的存活率（n = 3，单因素方差分析）。

图 4  PMDC NPs诱导结肠癌铁氧化。(A-F）通过荧光成像（A，D）、流式细胞仪分析（B，E）和流式细胞仪统计分析（C，F）（n = 3，单因素方差分析）评估不同处理后 CT26 和 RKO 细胞的脂质过氧化水平。缩放条：50 μm。(G、H）分析不同处理后 CT26（G）和 RKO（H）细胞中的 MDA 水平（n = 3，双向方差分析）。(I、J）不同处理后，测量 CT26（I）和 RKO（J）细胞中 GSSG/GSH 的比率（n = 3，单因素方差分析）。(K，L）对 CT26（K）和 RKO（L）细胞中的 GPX4 进行 Western 印迹分析。(M，N）CT26（M）和 RKO（N）细胞中 GPX4 蛋白水平的定量分析（n = 3，单因素方差分析）。(O，P）与 PMDC NPs 一起孵育 CT26（O）和 RKO（P）细胞的特定组的存活率（n = 3，单因素方差分析）。(Q、R）与 PMDC NPs 一起孵育 CT26（Q）和 RKO（R）细胞的特定组 GPX4 的免疫印迹分析。(S，T）在与 PMDC NPs 一起孵育后，对有或没有 10 μM Fer-1 的特定组 CT26（S）和 RKO（T）细胞中 GPX4 蛋白水平的定量分析进行了评估（n = 3，单因素方差分析）

图 5. PMDC NPs在体外触发结肠癌的ICD。(A, B) 使用免疫荧光分析CORM-401、DHA、MDC NPs和PMDC NPs处理后CT26细胞中CRT（A）和HMGB1（B）的内源性水平。缩放条 = 20 μm（A）。缩放条：60 μm（B）。(C）不同处理后 CT26 细胞中的 ATP 含量（n = 3，单因素方差分析）。(D、E）对 CT26（D）和 RKO（E）细胞进行指定干预后的 CRT 和 HMGB1 的 Western 印迹分析。(F、G）定量分析 CT26（F）和 RKO（G）细胞中 CRT 和 HMGB1 蛋白水平（n = 3，单因素方差分析）。(H）流式细胞仪数据和（I，J）指定处理后 T 细胞（CD3+CD4+/CD3+CD8+）的定量分析（n = 3，单因素方差分析）。(K）流式细胞仪数据和（L）不同处理后成熟 DC（CD11c+CD80+CD86+）的统计评估（n = 3，单因素方差分析）。(M）流式细胞术结果和（N）特定干预后 Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）的定量分析（n = 3，单因素方差分析）。(O）流式细胞术数据和（P）指定干预措施后 M1 TAMs（CD11b+F4/80+iNOS+）的定量分析（n = 3，单因素方差分析）。(Q）流式细胞术结果和（R）不同处理后 M2 TAMs（CD11b+F4/80+CD206+）的定量分析（n = 3，单因素方差分析）

图 6 PMDC NPs 在体内的抗结肠癌效果。(A) 实时体内成像显示，静脉注射 IR780、MOF5@IR780 NPs 和 pHCT74/MOF-5@IR780 NPs 后，IR780、MOF5@IR780 NPs 和 pHCT74/MOF-5@IR780 NPs 在携带 CT26 肿瘤的 BALB/c 小鼠模型中的分布和积累情况。白圈表示肿瘤的位置。(B) 24 小时后各组解剖器官和肿瘤的荧光成像。(C）在 BALB/c 小鼠模型中治疗 CT26 肿瘤的计划和步骤示意图。(D）所示组别中单个肿瘤的图像（n = 5）。(E）各组肿瘤体积比较（n = 5，双向方差分析）。(F）不同组小鼠的平均体重（n = 5）。(G）接受不同治疗配方的小鼠的肿瘤抑制比和肿瘤重量（n = 5，单因素方差分析）。(H-N）8-OHdG、细胞色素 C、HMGB1、Cleaved-caspase 3、GPX4 和 Ki67 表达评分的代表性免疫组化图像（H）和免疫组化图像定量（I-N）（n = 5，单因素方差分析）。比例尺：200 μm

图 7 PMDC NPs 在体内诱导抗肿瘤免疫反应。(A）描述治疗双侧肿瘤策略的示意图。(B、C）相应图像显示（B）远端肿瘤和（C）原发肿瘤。(D、E）不同组别（D）远端肿瘤和（E）原发肿瘤的重量和抑制率（n = 5，单因素方差分析）。(F、G）不同时间点各组（F）远端肿瘤和（G）原发肿瘤的体积（n = 5，双向方差分析）。(H）各组小鼠在特定时间点的体重（n = 5）。(I-M）具有代表性的免疫组化图像（I）以及 HMGB1、CD8a、Foxp3 和 Ki67 表达评分的定量分析（J-M）（n = 5，单因素方差分析）。标尺：200 μm。(N-R）流式细胞术分析（N）细胞毒性 T 细胞（CD3+CD4+/CD3+CD8+）、（O）DCs（CD11c+CD80+CD86+）、（P）Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）、 (Q) 指定治疗后远处肿瘤中的 M1 TAMs（CD11b+F4/80+iNOS+）和 (R) M2 TAMs（CD11b+F4/80+CD206+）（n = 3）。(S-X）对不同治疗后远处肿瘤中（S，T）细胞毒性 T 细胞、（U）DCs、（V）Tregs、（W）M1 TAMs 和（X）M2 TAMs 的定量进行评估（n = 3，单因素方差分析）

图 8 PMDC NPs 可抑制结肠癌复发。(A) 小鼠康复过程示意图。(B) 不同组的肿瘤解剖照片（n = 5）。(C) 相应的肿瘤切除图片。红色周期线代表肿瘤部位（n = 5）。(D) 完成不同治疗后复发肿瘤的生物发光图像。(E）各组肿瘤体积比较（n = 3，学生 t 检验）。(F）不同治疗组小鼠的肿瘤重量。(G）不同组小鼠的体重（n = 5）。(H-J）流式细胞术分析和量化不同治疗组小鼠脾脏中的TCM（CD3+/CD8+/CD44+/CD62L+）和TEM（CD3+/CD8+/CD44+/CD62L-）（n = 3，学生t检验）。红色方框代表TCM，蓝色方框代表TEM

结论

总之，本研究采用简单有效的薄膜分散法成功合成了 PMDC NPs，用于 DHA 和 CORM-401 的给药。这种纳米平台解决了 DHA 和 CORM-401 的局限性，提高了它们的生物利用度。PMDC NPs系统具有特异性肿瘤靶向能力，这可能是由于被动EPR效应以及pHCT74肽与结肠癌细胞表面过表达的α-烯醇化酶结合所介导的主动靶向效应。重要的是，负载CORM-401的PMDC NPs能够通过消耗ROS在肿瘤细胞内迅速生成CO，从而有效抑制结肠癌细胞的生长。此外，体外和体内研究结果都验证了 PMDC NPs 在促进氧化应激诱导的细胞凋亡和铁凋亡方面表现出卓越的功效。这最终导致诱导 ICD 和激活全身免疫反应，有效抑制结肠癌的生长和复发。因此，本研究提出了一种新型纳米中药给药系统，它能协同结合化疗、免疫疗法和一氧化碳气体疗法，为治疗结直肠癌提供了一种前景广阔的有效替代方案。