Journal of Controlled Release|阿仑膦酸盐聚合物胶束在大鼠模型中将淫羊藿苷靶向作用于骨骼缓解骨质疏松

将药物配制成靶向疾病部位的纳米颗粒，可以以较低的药物剂量和较低的脱靶不良反应产生强大的治疗效果。目前还鲜有将药物靶向作用于骨骼的方法，这阻碍了骨质疏松症的治疗。本研究利用阿仑膦酸钠能与骨中的羟基磷灰石紧密结合的特性，将含有植物黄酮类化合物淫羊藿苷的聚合物胶束靶向作用于骨质疏松症病灶。来自淫羊藿的传统中药淫羊藿苷先前已被证明可抑制脂肪生成并增强骨间充质干细胞的成骨作用，但这种化合物本身在血液中的存留时间很短。本研究载有淫羊藿苷的胶束与缺乏阿仑膦酸盐时相比，该递送系统在骨质疏松症大鼠模型中对脂肪生成和成骨激活的抑制更强。这些结果明确了使用阿仑膦酸钠靶向骨损伤部位的成骨植物分子的可行性，这可能指导开发针对骨质疏松症和其他骨骼疾病的有效疗法。

图1 阿仑膦酸功能化聚合物胶束的总体合成方案及制备。(A)室温下通过碳二酰亚胺反应将阿仑膦酸钠与聚乙二醇的两侧偶联生成聚合物胶束，配制成mPEG-PLA聚合物容器并装载淫羊羊苷的示意图。(B)制备装载淫羊藿苷的阿仑膦酸功能化聚合物胶束的示意图。(C) ALN- pegaln共轭物和(D)游离ALN在D2O (400 MHz)中的1H NMR谱图。ALN，阿仑膦酸钠;PEG，聚乙二醇;mPEG-PLA，甲氧基聚乙二醇-聚乳酸。

图2 不含淫羊羊苷或阿仑膦酸酯的空聚合物胶束(empty PM)、不含淫羊羊苷和阿仑膦酸酯的聚合物胶束(ALNPM-ICT)或不含淫羊羊苷(PM- ict)的表征。(A)基于透射电子显微镜的形态学。(B)临界胶束浓度。(C) 37◦C条件下48 h内游离淫羊羊苷在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中的累积体外释放。(D)阿仑膦酸钠(ALN-PM)、ALN-PM-ICT和游离淫羊羊苷(ICT)功能化的空聚合物胶束的傅里叶变换红外光谱。数据以mean±SD表示(n = 3)。ALN，阿仑膦酸钠;PM，聚合物胶束;ICT, icaritin;PDI，多分散性指数。

图3 阿仑膦酸功能化聚合物胶束与羟基磷灰石的体外结合。将含有荧光染料香豆素-6和阿仑膦酸钠(ALN-PM-Cou6)或不含(PM-Cou6)的聚合物胶束与(A)体外制备的羟基磷灰石或(B)羟基磷灰石的商业制剂一起孵育。对于每种条件，第一列显示两种羟基磷灰石的代表性扫描电镜图，第二列和第三列显示ALN-PM-Cou6或PM-Cou6与羟基磷灰石结合前后的荧光发射光谱。

图4 不同配方淫羊藿素诱导大鼠骨间充质干细胞的分化。(A)流式细胞术分析骨髓间充质干细胞的细胞表面标记(n = 3)。(B)不同剂量(0 μM - 50 μM)淫羊糖素处理骨髓间充质干细胞72 h后的细胞活力，通过三个独立实验的MTT法测定。(C)不同配方淫羊藿苷在成骨分化培养基或成脂分化培养基中培养10天的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色和油红O染色。(D)骨髓间充质干细胞在含各种淫羊藿苷制剂的成骨分化培养基中培养后第10天测定的ALP活性。单位nmol/min/mg蛋白质表示酶的催化效率与样品中蛋白质含量的关系。(E)用淫羊藿苷制剂在成骨分化培养基中处理10天的骨髓间充质干细胞钙结节的茜素红染色。(F)用淫羊藿苷制剂处理的骨髓间充质干细胞在成脂分化培养基中10天的脂滴油红O染色。ALN，阿仑膦酸钠;骨间充质干细胞;PM，聚合物胶束;ICT, icaritin;碱性磷酸酶。

图5 高分子胶束对骨质疏松大鼠股骨力学性能的影响。按照方法所述方法诱导疾病模型，在诱导后4周，动物分别接受生理盐水、不含淫羊腿素或阿仑膦酸的空聚合物胶束(empty PM)、不含阿仑膦酸的载淫羊腿素胶束(PM-ICT)、载淫羊腿素胶束(ALN-PM-ICT)或游离淫羊腿素(ICT)治疗。假手术组采用模拟手术诱导骨质疏松，并用生理盐水代替药物或胶束治疗。治疗6周后，处死动物，取下左股骨，测定以下力学参数:(A)峰值载荷，(B)极限刚度，(C)韧性，(D)极限强度，(E)杨氏模量。

图6 dir标记制剂在大鼠组织中的生物分布。用荧光染料DiR标记有阿仑膦酸钠(ALN-PM-DiR)或没有阿仑膦酸钠(PM-DiR)的聚合物胶束。所得制剂经尾静脉静脉注射到大鼠体内。在3、8和12小时后，处死动物，切除肌肉、脊柱和股骨，使用IVIS成像系统进行分析。1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基三碳氰碘化。

图7 高分子胶束对骨质疏松大鼠股骨皮质孔隙率的影响。动物按图5所示处理，动物被处死，并通过扫描电镜检查股骨干近端。(A)代表性扫描电子显微图。(B)根据孔隙大小分布的皮质孔隙度定量。拟合分布及其平均孔径叠加在观测数据上。(C)按平均孔径计算的皮质孔隙度定量。

图8 高分子胶束对骨质疏松大鼠模型化学成分的影响。(A)能量色散x射线光谱和(B)骨中钙含量、磷含量和钙磷比分析。ALN，阿仑膦酸钠;PM，聚合物胶束;ICT, icaritin。

图9 不同治疗方法对小梁骨微结构影响的显微计算机断层扫描。(A, I)骨小梁微结构三维图像和(A, II)股骨颈二维显微ct图像。(B-G)定量表征指标包括(B)相对骨体积(BV/TV)、(C)每骨体积骨表面积(BS/BV)、(D)骨小梁厚度(Tb.Th)、(E)骨小梁数目(Tb.N)、(F)骨小梁间距(Tb.Sp)、(G)骨小梁骨密度(BMD)，ALN，阿仑膦酸钠;PM，聚合物胶束;ICT, icaritin。

图10 不同处理对骨小梁组织形态学及骨转换指标的影响。骨质疏松大鼠给予生理盐水作为对照，不含伊卡虫素或阿仑膦酸的空聚合物胶束(empty PM)，含有伊卡虫素和阿仑膦酸的聚合物胶束(ALN-PM-ICT)或不含伊卡虫素(PM-ICT)，或游离伊卡虫素(ICT)。(A)苏木精-伊红染色股骨颈。(B - C)股骨颈染色(B)骨吸收标志物抗酒石酸磷酸酶5b (TRACP 5b)或(C)骨形成标志物碱性磷酸酶(ALP)。红色箭头表示成熟的破骨细胞。(D - F)小梁骨动态组织形态学参数的定量研究，包括(D)小梁面积比例，(E)破骨细胞比例，(F)成骨细胞比例。(G-H)定量分析(G) ALP和(H) TRACP 5b。ALN，阿仑膦酸钠;PM，聚合物胶束;ICT, icaritin。

结论

在这里，本研究提供了强有力的证据，证明含有阿仑膦酸钠的聚合物胶束可以靶向骨质疏松症，并在大鼠模型中部分恢复骨的微结构。这些发现证实了阿仑膦酸钠靶向骨质的可行性，这是一项重要的成就，因为如果没有这种靶向性，注射的小分子在降解或清除之前只有不到 1% 能到达骨骼。