Antioxidants| 迷迭香酸通过调节 TLR9/NF-κB 信号通路和肠道菌群减轻肠炎沙门氏菌诱导的炎症

肠炎沙门氏菌 （SE） 感染破坏了肠道微生物群的稳态，引起肠道炎症反应，对人类和动物健康构成巨大威胁。抗生素的不合理使用导致耐药性 SE 的患病率增加，增加了控制 SE 的难度。因此，迫切需要新的药物策略和研究来控制 SE。迷迭香酸 （RA） 是一种天然酚酸，具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎和抗菌特性。然而，RA 对肠道炎症和 SE 引起的肠道微生物疾病的保护作用和机制尚未完全阐明。在本研究中，用 SE 攻击 RAW264.7 细胞、 MCECs 和 BALB/c 小鼠，以评估 RA 的保护作用和机制。结果显示，RA 增强了 RAW264.7 细胞的吞噬能力，降低了 SE 在 MCECs 中的侵袭和粘附能力，并抑制了 SE 诱导的细胞炎症。此外，RA 通过上调 TLR9 表达抑制 NF-κB 信号通路的激活。重要的是，我们发现 RA 提供了对 SE 的保护，并增加了小鼠肠道微生物群的多样性和丰度。与感染控制相比，RA 显著增加了厚壁菌门 （Firmicutes） 和酸杆菌 （Acidibacteria） 的丰度，降低了变形菌门 （Proteobacteria） 、 上链杆菌门 （Epsilonbacteraeota） 和拟杆菌门 （Bacteroidota） 的丰度。然而，RA 未能缓解 SE 诱导的炎症，并且在用广谱抗生素破坏肠道菌群后失去了对 TLR9/NF-κB 信号通路的调节作用。 这些结果表明，RA 通过调节 TLR9/NF-κB 信号通路和维持肠道菌群的稳态来减轻 SE 诱导的炎症。我们的研究为预防 SE 诱导的肠道炎症提供了一种新策略。

图2 RA通过调节TLR9/NF-κB信号通路减轻SE引起的炎症。不同浓度RA预处理细胞6 h, SE攻毒(MOI = 100) 2 h;收集细胞进行RT-qPCR或Western blot检测。(A) RA与TLR9结合模式及亲和力的分子对接分析。(B-D) RAW264.7细胞中TLR9、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平(n = 6)。(E-G) MCECs中TLR9、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平(n = 6)。(H-O) TLR9、p65、p-p65、RAW264.7细胞和mcc中IκB-α和p-IκB-α的表达(n = 3)。

图3 RA通过上调TLR9抑制NF-κB信号通路的激活。细胞用10 μM E6446 (TLR9抑制剂二盐酸)预处理2 h，与RA共孵育6 h，再用SE (MOI = 100)攻毒2 h，收集细胞上清液检测细胞因子，收集细胞进行RT-qPCR或Western blot检测。(A,B) RAW264.7细胞和MCECs中促炎细胞因子的表达水平(n = 6) (C-E) RAW264.7细胞中TLR9、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平(n = 6) (F-H) MCECs中TLR9、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平(n = 6) (I-L) TLR9、p65、p-p65、(M-P) MCECs中TLR9、p65、pp65、i - κB-α和p- i - κB-α的蛋白表达水平(n = 3)。

图4。类风湿关节炎对硒激发小鼠的保护作用。(A)评估RA对SE攻毒小鼠存活率影响的实验设计。小鼠口服RA (20 mg/kg·bw)预处理7 d，然后腹腔注射浓度为2.5 × 108 cfu /mL的SE 0.2 mL。记录小鼠死亡率。(B)小鼠存活率(n = 20)。(C)检测RA对SE保护作用的实验设计。小鼠的处理和攻毒与(A)相同，在攻毒后24 h采集样品。(D)小鼠体重变化(n = 10)。(E)疾病活动性指数(n = 10)。(F,G)结肠长度测量(n = 6) (H)十二指肠和结肠组织病理学变化(n = 3) (I)十二指肠组织病理学评分(n = 3) (J)结肠组织病理学评分(n = 3)。

图5 RA通过调节TLR9和抑制NF-κB信号通路的激活来减轻se诱导的肠道炎症。小鼠口服RA (20 mg/kg·bw)预处理7 d，腹腔注射浓度为2.5 × 108 cfu /mL的SE 0.2 mL，图5。RA通过调节TLR9和抑制NF-κB信号通路的激活来减轻se诱导的肠道炎症。小鼠口服RA (20 mg/kg·bw)预处理7 d，腹腔注射浓度为2.5 × 108 cfu /mL的SE 0.2 mL，攻毒24 h后采集样品。(A-D)血清GOT、GPT、MDA、SOD水平(n = 6)。(E)血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平(F-H)。结肠组织中TLR9、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平(n = 6)。(I-L)结肠组织中TLR9、p65、p-p65、i - κ b -α、p- i - κ b -α蛋白表达水平(n = 3)。

图6 RA对SE攻毒小鼠肠道菌群有调节作用(n = 6)。小鼠先口服RA (20 mg/kg·bw)预处理7 d，然后腹腔注射浓度为2.5 × 108 cfu /mL的SE 0.2 mL。(A) Circos图。(B) Alpha多样性分析:观察到的otu。(C) Alpha多样性分析:Shannon指数。(D) α多样性分析:(E) β多样性分析:PCoA。(F)属水平上肠道微生物群的相对丰度。(G-K) p__Proteobacteria, p__Epsilonbacteraeota, p__Bacteroidota, p__厚壁菌门和p__放线菌门的相对丰度。(L)属水平上肠道菌群的相对丰度。(M-R) g_ muribaculaceae_ unclassified、g_ bilophila、g_ tyzzerella、g_ lachnospiraceae_nk4a136_group、g_ acetatifactor、g_ n肠菌属的相对丰度。

图7 RA在清除菌群后失去了对SE的保护作用。(A)小鼠实验设计。小鼠分别口服RA (20 mg/kg·bw)或抗生素预处理7 d，并腹腔注射浓度为2.5 × 108 cfu /mL的SE 0.2 mL，攻毒24 h后采集样品(n = 10)。(B)体重变化(n = 10)。(C)疾病活动性指数(n = 10)。(D,E)结肠长度测量(n = 10)。(F)肝、肾、脾脏器指数(n = 10)。(G)血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平(n = 6)。(H)十二指肠组织病理变化(n = 3)。(I)十二指肠组织病理评分(n = 3)。(B)采用Kruskal-Wallis检验进行统计学分析，并将SE感染对照组与其他各组进行比较。对于(C-I)，采用单因素方差分析进行统计分析，然后采用Tukey的图7。RA在清除菌群后失去了对SE的保护作用。(A)小鼠实验设计。小鼠分别口服RA (20 mg/kg·bw)或抗生素预处理7 d，并腹腔注射浓度为2.5 × 108 cfu /mL的SE 0.2 mL，攻毒24 h后采集样品(n = 10)。(B)体重变化(n = 10)。(C)疾病活动性指数(n = 10)。(D,E)结肠长度测量(n = 10)。(F)肝、肾、脾脏器指数(n = 10)。(G)血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平(n = 6)。(H)十二指肠组织病理变化(n = 3)。(I)十二指肠组织病理评分(n = 3)。

图8 清除菌群后，RA无法通过调节TLR9抑制NF-κB信号通路。小鼠口服RA (20 mg/ kg·bw)和抗生素预处理7 d，然后腹腔注射浓度为2.5 × 108 cfu /mL的SE 0.2 mL。攻毒后24 h采集样品。(A-C)结肠组织中TLR9、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平(n = 6)。(D-G)图8中TLR9、p65、p-p65、i - κ b -α、p- i - κ b -α蛋白表达水平。清除菌群后，RA无法通过调节TLR9抑制NF-κB信号通路。小鼠口服RA (20 mg/ kg·bw)和抗生素预处理7 d，然后腹腔注射浓度为2.5 × 108 cfu /mL的SE 0.2 mL。攻毒后24 h采集样品。(A-C)结肠组织中TLR9、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平(n = 6)。(D-G)结肠组织中TLR9、p65、p-p65、i - κ b -α、p- i - κ b -α蛋白表达水平(n = 3)。

结论

综上所述，本研究结果表明，RA通过上调TLR9和抑制NF-κB信号通路来减轻se诱导的炎症，这与维持小鼠肠道菌群稳态密切相关。补充RA可能是一种预防策略，以减轻SE对人类和动物造成的损害。本研究为RA在SE感染防治中的应用和发展提供了理论支持。