ACS Applied Materials & Interfaces|线粒体靶向淫羊藿苷纳米颗粒诱导肝细胞癌免疫原性细胞死亡

肝细胞癌(HCC)是一种对化疗和免疫治疗具有耐药性的高度恶性肿瘤。淫羊藿苷(Icaritin, ICT)作为一种传统中药，已被报道为治疗晚期不可切除肝癌的免疫调节剂。ICT诱导线粒体自噬引起免疫原性细胞死亡(ICD);然而，ICT较差的生物利用度限制了其治疗效果和临床应用。因此，本研究旨在评估使用聚(2-(n -氧化物，n -二乙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)-b-聚(ε-己内酯)共聚物(OPDEA-PCL)将ICT包封成纳米颗粒(ICT NPs)的效果。OPDEA-PCL/ICT NPs与线粒体共定位，促进ICT在小鼠HCC H22细胞中的ICD诱导作用。在H22皮下肿瘤模型中，静脉注射OPDEA-PCL/ICT NPs通过对线粒体自噬的影响，在肿瘤内快速积累，有效激活全身抗癌免疫原性。结果肿瘤抑制率为60%，显著高于游离ICT和聚乙二醇(PEG)-PCL/ICT NPs。此外，与PBS相比，OPDEA-PCL/ICT NPs也延长了小鼠的生存时间近2倍。总之，该方法为提高ICT对HCC的免疫治疗效果提供了有价值的见解。

图2 OPDEA-PCL/ICT NPs通过线粒体自噬增强肝癌H22细胞的ICD。(A)流式细胞术分析H22细胞中OPDEACy5PCL/ICT NPs和PEGCy5-PCL/ICT NPs的细胞摄取情况(Cy5-eq浓度:0.5 μg mL−1)。(B) H22细胞孵育1h后PEGCy5-PCL/ICT和OPDEACy5-PCL/ICT NPs与线粒体共定位。Cy5荧光显示为红色，线粒体荧光显示为绿色。(C) Cy5荧光与MitoTracker Green荧光沿着选定的细胞线重叠的轮廓(在放大图像中用红线表示)。(D)利用ImageJ软件按像素强度计算Cy5与MitoTracker Green的Manders相关系数。将细胞与OPDEACy5-PCL/ICT NPs和PEGCy5-PCL/ICT NPs (Cy5-eq浓度:0.5 μg mL−1)一起培养1小时。(E) Western blot分析H22细胞中粉色-1、Parkin和LC3B的表达。将H22细胞与ICT、PEG−PCL/ICT或OPDEA-PCL/ICT NPs孵育24小时。每种条件下的样品分别代表三个独立的实验。GAPDH作为加载控制。(F) ImageJ软件定量LC3B−II/LC3B−I比值(n = 3)。(G)不同处理后H22细胞上CRT从内质网转移到细胞表面和HMGB1从细胞核释放到胞质/胞外环境的免疫荧光染色(CRT:红色，HMGB1:绿色，细胞核:蓝色)。标尺为20 μm。(H)流式细胞术分析不同浓度ICT和ICT NPs培养4小时后H22细胞中CRT的表达(n = 3)。(I) ELISA分析不同浓度ICT NPs和ICT处理后H22细胞上清中释放的HMGB1 (n = 3)。(J)不同浓度ICT和ICT处理后的细胞外ATP浓度ICT和ICT NPs浓度(n = 3)。

图3 ICT NPs在H22荷瘤小鼠体内的生物分布及肿瘤穿透性。(A)荷瘤小鼠活体图像。单次静脉注射OPDEA-PCL/ICT@DiD NPs和PEG -PCL/ICT@DiD NPs (DiD-eq浓度:2 mg kg−1)后，切除肿瘤和脏器(心、肝、脾、肺和肾)。(B)不同时间处理后肿瘤的荧光强度定量(n = 3)。(C)单次注射后12 h不同处理后小鼠各器官ICT NPs的平均荧光强度定量(n = 3)。(D) ICT NPs的免疫荧光切片染色。给H22皮下荷瘤小鼠静脉注射游离DiD、OPDEA-PCL/ICT@DiD NPs和PEP -PCL/ICT@DiD NPs;然后解剖肿瘤组织进行免疫荧光切片染色。用ImageJ软件定量测定NPs的免疫荧光。每个值被量化为随机选择的3个字段的平均值;比例尺:100 μm (n = 3)。

图4 opdea - pcl /ICT NPs对H22肿瘤的抗肿瘤活性。(A)肿瘤接种及治疗方案，Balb/c小鼠右腋窝皮下注射H22细胞(1 × 106)。第4天，开始静脉注射OPDEA-PCL/ICT NPs、PEG -PCL/ICT NPs和游离ICT (ICT: 20 mg/kg)。当肿瘤体积达到1000mm3时确定终点。(B)治疗期间小鼠体重曲线。(C)注射后第22天各组荷瘤小鼠图像。(D)小鼠肿瘤生长曲线。(E)治疗后H22荷瘤小鼠的生存曲线见图4A。(F)治疗后H22皮下肿瘤组织LC3B−II表达的免疫荧光染色。(G)肿瘤切片TUNEL检测。(H)肿瘤HE染色及马松三色分析(标尺:200 μm)。

图5 流式细胞术分析游离ICT和ICT NPs治疗后的肿瘤免疫微环境，分别为活化的dc (A)、CD8+ T细胞(B)、CTL (C)、CD4+ T细胞(D)和Tregs (E) (n = 3)。

图6 OPDEA-PCL/ICT NPs处理后小鼠生物安全性评价。(A)小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)的HE染色。标尺:100 μm。(B)肝肾功能指标(n = 4)。(C)血常规分析(n = 4)。

结论

总之，本证明了一种通过开发靶向线粒体的ICT NPs来治疗HCC的免疫治疗策略。OPDEA-PCL的这一独特特征促进了ICT在HCC细胞线粒体中的积累，从而通过线粒体自噬增强了ICD。在H22皮下肿瘤模型中，OPDEA-PCL/ICT NPs实现了60%的肿瘤抑制率，与对照组相比，中位生存时间延长了近2倍。进一步分析表明，肿瘤免疫抑制微环境被强烈调节，包括DC激活、CD8+ T细胞浸润、MDSCs和Tregs下调，为HCC治疗提供了临床治疗潜力。