摘要
类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜增生和软骨侵蚀。本研究阐明了黄酮类化合物的主要成分槲皮素治疗类风湿性关节炎的潜在作用机制。本研究在 Wistar 大鼠中创建了一个胶原诱导的关节炎 （CIA） 模型，通过胃灌注连续给予槲皮素 （50 或 100 mg/kg） 4 周。采用关节炎评分、组织病理学染色、放射学评估和血清生化指标研究槲皮素对疾病改善的影响。此外，采用免疫荧光检测大鼠关节中 JAK1/STAT3/HIF-1α 的表达。使用流式细胞术、CCK8 和 transwell 测定在体外 MH7A 细胞模型中评估槲皮素 （20、40 和 80 μmol/L） 对滑膜成纤维细胞性质和行为的影响。此外，通过定量实时 PCR 评估炎性细胞因子 IL1β 、 IL6 、 IL17 和 TNFα 的 mRNA 表达水平。葡萄糖、乳酸、乳酸脱氢酶、丙酮酸、丙酮酸脱氢酶和三磷酸腺苷检测试剂盒检测槲皮素对滑膜成纤维细胞的代谢影响。最后，采用免疫印迹检测槲皮素对滑膜成纤维细胞 JAK1/STAT3/HIF-1α 信号通路的影响。 体内实验证实了槲皮素对 CIA 大鼠的有利作用，包括改善关节炎评分和减少踝骨破坏，此外还减少了血清中促炎细胞因子 IL-1β、IL-6、IL-17 和 TNF-α。免疫荧光证实槲皮素可能通过抑制 JAK1/STAT3/HIF-1α 信号传导来改善 CIA 大鼠的关节损伤。各种体外实验表明，槲皮素有效抑制 IL-6 诱导的 MH7A 细胞增殖并减少其迁移和侵袭行为，同时诱导细胞凋亡并在 mRNA 水平上降低促炎细胞因子 IL1β 、 IL6 、 IL17 和 TNFα 的表达。槲皮素抑制 MH7A 细胞中的葡萄糖、乳酸、乳酸脱氢酶、丙酮酸和三磷酸腺苷，并增加丙酮酸脱氢酶的表达。进一步证实槲皮素可能通过 JAK1/STAT3/HIF-1α 信号传导抑制 MH7A 细胞的能量代谢和炎症因子分泌。槲皮素对多个靶分子和途径的作用使其成为类风湿性关节炎软骨损伤的有前途的治疗方法。槲皮素通过减少关节炎症、改善关节代谢稳态和降低免疫系统活化能，抑制 JAK1/STAT3/HIF-1α 信号通路以改善疾病状态。
图文简介
图1 槲皮素抑制 MH7A 细胞的增殖。（A） 槲皮素在 HIF-1α 位点的分子对接。（B） 添加 50 ng/mL IL6 后 5、10、20、40、80 和 100 μM 槲皮素对 MH7A 细胞的抗增殖作用 （n = 3） （C）槲皮素 IC50
图2 槲皮素抑制 MH7A 细胞转移，并诱导细胞凋亡。（A、B）槲皮素处理后使用 transwell 测定评估 MH7A 细胞转移 （n = 5）。（C） 膜联蛋白 V-FITC/PI 染色后，通过流式细胞术检测活动性细胞凋亡中的 MH7A 细胞 （n = 3）。（D） 通过 RT-qPCR 评估的 IL-1β、IL-6、IL-17 和 TNF-α mRNA 表达 （n = 3）。
图3 槲皮素降低 IL6 诱导的 MH7A 细胞氧化应激和能量代谢。（A） 槲皮素在蛋白质和 mRNA 水平上降低 MH7A 细胞中 HIF-1α 的表达水平 （n = 3）。（B） 槲皮素对 MH7A 细胞中葡萄糖、LDH、LA、PA、PDH 和 ATP 水平的影响 （n = 4）。
图4 槲皮素对 MH7A 细胞 JAK1/STAT3/HIF-1α 信号传导的影响。（A） JAK1/STAT3/HIF-1α 信号通路中的串扰。使用免疫印迹评估的蛋白质表达水平 （n = 3）。（B） 使用免疫印迹法评估 JAK1 、 STAT3 和 HIF-1α 蛋白表达水平 （n = 3）。
图5 槲皮素改善 CIA 大鼠骨骼损伤。（A） 建立 CIA 模型和执行药物治疗方案（Que 和 Tofacitinib）示意图。（B） 各组之间关节肿胀和整体评估的分数变化的比较。（C） 各组关节形态。（D） 各组啮齿动物踝关节的组织病理学比较 。（E） 组间啮齿动物踝关节的 micro-CT 图像比较 。（F） 各组中踝关节的组织。（G） TMD 的形态数据 （g/mm3）、BMD 和 BV/TV （%） 在膝关节和踝关节 中。
图6 槲皮素抑制 CIA 大鼠的炎症因子表达。（A） 使用 ELISA 评估促炎细胞因子水平，包括 IL-1β 、 IL-6 、 IL-17 和 TNF-α （n = 4）。（B） 槲皮素对 CIA 大鼠肝功能参数的影响。（C） 槲皮素对肾功能参数的影响。
图7 CIA 大鼠踝关节中JAK1/STAT3/HIF-1α 免疫荧光。（A） 影响 CIA 大鼠踝关节免疫荧光水平，包括 JAK1、STAT3 和 HIF1α。（B - D）CIA 大鼠踝关节的免疫荧光水平，包括 JAK1、STAT3 和 HIF1α 。
图8 槲皮素对类风湿性关节炎中 JAK1/STAT3/HIF-1α 信号传导的影响。槲皮素对类风湿关节炎滑膜细胞的调控作用主要涉及 JAK1/STAT3/HIF-1α 信号传导及其下游代谢和分子调控。
结论
本研究发现槲皮素有效减轻了关节和骨骼损伤以及关节炎症，使大鼠的炎症得到整体改善。本研究还发现了 HIF-1α 在滑膜成纤维细胞中发挥的重要作用，它通过增强糖酵解来减少炎症反应，从而有助于解决能量代谢紊乱。此外，本研究发现 JAK1/STAT3 作用于 HIF-1α 的上游，槲皮素对 JAK1/STAT3/HIF-1α 信号传导的影响通过体外和体内实验得到验证。总体而言，本研究数据表明，槲皮素可以通过调节 JAK1/STAT3/HIF-1α 信号传导来平衡免疫炎症系统和能量代谢，从而潜在地治疗 RA，为揭示槲皮素对 RA 的积极治疗作用提供了新的方向。
DOI: 10.1186/s10020-024-00929-1
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