摘要
PD-1治疗非小细胞肺癌(NSCLC)患者的疗效仍不令人满意。激活STING通路是提高PD-1抑制剂疗效的一种有希望的策略。本研究发现粉防己碱(tetrandrine, TET)是一种从中药常用药用植物中提取的抗肿瘤化合物，具有抑制NSCLC肿瘤生长的能力。在机制上，TET诱导核DNA损伤，增加细胞质dsDNA，从而激活STING/TBK1/IRF3通路，进而促进小鼠树突状细胞(dc)、巨噬细胞和CD8+ T细胞的肿瘤浸润。体内成像动态监测TET治疗后STING通路活性的增加，并预测肿瘤免疫微环境的激活。我们进一步发现TET联合αPD-1单克隆抗体(αPD-1 mAb)可促进CD8+ T细胞浸润，增强其细胞杀伤作用，从而降低肿瘤的生长，延长NSCLC小鼠的生存期，具有显著的抗癌作用。因此，TET可以通过激活STING通路，有效消除NSCLC细胞，提高免疫治疗效果，TET与抗pd -1免疫治疗联合应用值得进一步探索。
图文简介
图1 TET显著抑制NSCLC细胞增殖，促进细胞凋亡。(A) TET的化学式。(B) CCK8检测不同浓度TET作用24、48和72 h后H358和H2030细胞的活力。(C-D) H358和H2030细胞暴露于不同浓度TET作用24 h, 14天后定量病灶形成。(E)暴露于TET 24小时后，流式细胞术检测H358和H2030细胞的凋亡情况。数据以均数±标准差表示(**P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001)。
图2 TET显著激活NSCLC细胞的STING通路。(A)将H358细胞暴露于20µM TET作用24 h，进行RNA测序，分析转录组学变化，并测定差异基因表达。(B)通过基因本体(GO)富集分析，确定TET对H358细胞影响的关键通路。(C) H358细胞中受TET处理影响的免疫相关信号通路的GO富集分析。(D) Western blot检测H358和H2030细胞暴露于TET作用24 h后p-STING、STING、p-TBK1、TBK1、p-IRF3、IRF3、CXCL10和CCL5的水平。
图3 TET对非小细胞肺癌细胞的处理增加了胞质dsDNA的积累。(A) H358和H2030细胞TET作用24 h, Western blot检测γ-H2AX水平。(B)免疫荧光法检测TET作用后24 h H358和H2030细胞中γ-H2AX灶形成情况，并进行定量分析。标尺:50 μm。(C) H358和H2030细胞暴露于TET作用24 h后，通过Picogreen dsDNA荧光定量检测细胞内dsDNA的质量。(D) H358和H2030细胞暴露于TET作用24 h后，通过免疫荧光检测和定量dsDNA。比例尺:5 μm。数据用均数±标准差表示(**P < 0.01)。
图4 体外和体内监测TET治疗NSCLC中STING通路的活性。(A)报告基因示意图和实验方案说明了NSCLC小鼠生物发光成像(BLI)和TET治疗的时间。(B) H358-ISRE-Luc细胞和LLC1-ISRE-Luc细胞分别暴露于TET或载药24 h，用体外BLI检测Luc2和hRluc的活性，用体内BLI测量TET或载药处理后不同时间点NSCLC小鼠的Luc2与hRluc活性比值(C- f)的定量结果;以及Luc2活性(D)、hRluc活性(E)和Luc2与hRluc活性比(F)的定量结果。数据用均数±标准差表示(n =3， **P < 0.01， ***P < 0.001)。
图5 TET治疗可抑制NSCLC肿瘤生长，促进巨噬细胞、dc和CD8+ T细胞的浸润。(A) C57B/L6J小鼠分为Ctrl组和TET组。从治疗开始就评估肿瘤体积。(B)不同处理18天后NSCLC小鼠的肿瘤重量。(C)不同处理下NSCLC小鼠的存活率。(D-E)流式细胞术检测不同处理下NSCLC小鼠肿瘤微环境中巨噬细胞(D)或DCs (E)的比例。(F)流式细胞术检测不同处理下NSCLC小鼠肿瘤微环境中CD4+ T和CD8+ T细胞的比例。(G)定量RT-PCR检测不同组NSCLC肿瘤中CCL5、CXCL10 mRNA的表达。数据用均数±标准差表示(n =5， *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001)。
图6 TET通过增强CD8+ T细胞活性来增强αPD-1 mAb抗NSCLC肿瘤的有效性(A)从治疗开始评估对照、TET、αPD-1或TET + αPD-1组小鼠的肿瘤体积。(B)不同处理后第18天测量NSCLC小鼠的肿瘤重量。(C)不同处理下NSCLC小鼠的存活率。(D-G)对照、TET、αPD-1或TET + αPD-1组肿瘤组织中CD8+ T细胞总CD8+ T细胞(D)和TNF-α (E)、GzmB (F)、IFN-γ (G)表达的代表性流程图及其流式细胞术数据对比图。数据用均数±标准差表示(n =5， *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.001)。
结论
本研究表明TET能有效激活NSCLC中STING/ TBK1/IRF3通路。此外，本研究有效地监测了STING通路在体内的激活，这有可能预测肿瘤免疫微环境的激活。此外，TET能有效提高抗pd -1免疫治疗在NSCLC中的疗效。因此，TET是一种很有前景的NSCLC联合免疫疗法，具有有效根除癌细胞、增强免疫治疗效果的同时保持安全性的潜力，为目前对PD-1治疗及其他免疫疗法耐药的NSCLC患者提供了新的治疗策略。
DOI: 10.1016/j.phrs.2024.107314
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