摘要
背景：以山奈酚为代表的抗氧化剂已被证明对动脉粥样硬化 （AS） 有效。然而，其潜在机制仍不清楚。
目的：本研究旨揭示山奈酚治疗 AS 和泡沫状细胞积累的机制。
方法：本研究探讨了山奈酚对暴露于 ox-LDL 的 RAW26.7 巨噬细胞中炎症因子、清道夫受体 CD36、线粒体膜电位、ROS、MAPK/NF-κB、Nrf2/HO-1、Ca2+ 和 Piezo1 水平的作用。此外，为了探讨山奈酚是否通过 Piezo1 抑制 ox-LDL 诱导的泡沫状巨噬细胞，我们从 Piezo1 巨噬细胞特异性敲除 （Piezo1ΔLysM） 小鼠中提取了巨噬细胞。为了进一步验证，生成了 ApoE-/- 和 Piezo1 巨噬细胞特异性敲除小鼠 （Piezo1ΔLysM/ ApoE-/-）。
结果：结果显示，山奈酚显著抑制炎症反应、 CD36 表达、线粒体膜电位升高、 ROS 产生、MAPK/NF-κB 表达、Ca2+ 表达和 RAW264.7 中 Nrf2/HO-1 水平升高。此外，巨噬细胞 Piezo1 的耗竭还有效降低了小鼠 BMDMs 中脂滴沉积、炎症因子表达、氧化损伤、MAPK/NF-κB、Ca2+ 表达，并增加了 Nrf2/HO-1 的表达，山奈酚处理后结果仍然一致。体内研究表明，山奈酚可显着减少动脉粥样硬化斑块的形成。然而，山奈酚的有益作用在 Piezo1 耗竭小鼠中减弱。
结论：本研究结果表明山奈酚通过抑制 Piezo1 通道和 Ca2+ 内流来调节 CD36 介导的线粒体 ROS 产生，然后调节 NF-κB/MAPK 和 HO-1/Nrf2 的下游途径，抑制泡沫细胞的形成。
图文简介
图1 KAE 可缓解载脂蛋白E-/-小鼠强直性脊柱炎的进展。(B）载脂蛋白E-/-小鼠全主动脉的油红 “O ”染色图像。比例尺： 5 毫米。(C）（A）中油红 “O ”染色的统计结果（n = 4）。(D-E）血清中总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的表达（n = 6）。(F）不同组别载脂蛋白E-/-小鼠主动脉 HE 染色的代表性图像。比例尺：200 µm。(G）（F）中 HE 染色的统计结果（n = 4）。(J）主动脉根部区域的 IL-1β（红色）和 CD68（绿色）免疫荧光染色图像。缩放条： 50 μm。(n = 4). (H-I）不同组别载脂蛋白E-/-小鼠血清TNF-α和MCP-1炎症因子水平的表达。
图2 KAE 抑制 ox-LDL 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞炎症。（A） 用 100 μg/mL ox-LDL 处理后 RAW264.7 巨噬细胞中油红“O”染色的代表性图像。比例尺：50 μm。（B）（A）中油红 “O” 染色的统计结果（n = 5）。（C-F）100 μg/mL ox-LDL 处理后，RT-PCR 检测 RAW264.7 巨噬细胞中IL1b、IL6、 TNFα 和 MCP1 的 mRNA 水平 （n = 5）。（G-J）ELISA 检测 100 μg/mL ox-LDL 处理后 RAW264.7 巨噬细胞中 IL-6 、TNF-α 、IL-1β 和 MCP-1 的蛋白表达 （n = 5）。
图3 KAE 抑制 ox-LDL 诱导的 CD36 表达和 Ca2+流入。（A） 通过 FCM 定量显示 100 μg/mL ox-LDL 处理后 RAW264.7 巨噬细胞中 CD36 + 巨噬细胞的直方图。（A） 中比例 （B） 和 MFI （C） 的统计结果 （n = 3）。（D-E）100 μg/mL ox-LDL 和 KAE 处理后 RAW264.7 巨噬细胞中 CD36 蛋白水平 （n = 3）。（F） 100 μg/mL ox-LDL 处理后 RAW264.7 巨噬细胞不同组 CD36 的荧光图像。（G） 来自 （F） 的荧光图像的统计结果 （n = 4）。（H） Ca 的代表性荧光图像2+在不同组 RAW264.7 巨噬细胞中 （I） 来自 （H） 的荧光图像统计结果 （n = 4）。
图 4 KAE 抑制 ox-LDL 诱导的 RAW264.7 细胞线粒体氧化损伤。（A） 100 μg/mL ox-LDL 处理后 RAW264.7 细胞的 DCFH-DA 染色图像。比例尺：50 μm。（B） 100 μg/mL ox-LDL 处理后 RAW264.7 巨噬细胞 JC-10 染色图像。比例尺：50 μm。（C） 来自 （B） 的 JC-10 染色的统计结果 （n = 4）。
图5 KAE 通过 MAPK/NF-κB 和 Nrf2/HO-1 通路抑制炎症反应。（A-D）用 100 μg/mL ox-LDL 和山奈酚处理后，Western Blot 检测 RAW264.7 巨噬细胞中 p-JNK 、 JNK 、 p-ERK 、 ERK 、 p-p38 和 p38 的蛋白水平 （n = 3）。（E-F）用 100 μg/mL ox-LDL 和山奈酚处理后 Western Blot 在 RAW264.7 巨噬细胞中 p65 和 p-p65 的蛋白表达 （n = 3）。（G-I）用 100 μg/mL ox-LDL 处理后，Western Blot 在 RAW264.7 巨噬细胞中 Nrf2 和 HO-1 的蛋白水平 （n = 3）。（J） 100 μg/mL ox-LDL 处理后 RAW264.7 巨噬细胞不同组 Nrf2 的代表性荧光图像。（K） 来自 （J） 的荧光图像的统计结果 （n = 4）。
图 6 KAE 抑制 Piezo1 在ApoE （简体中文）-/-小鼠和 Yoda1 诱导的 Ca2+RAW264.7 巨噬细胞内流。（A） 主动脉根部区域用 Piezo1（红色）和 CD68（绿色）进行免疫荧光染色的图像。比例尺：50 μm。（B） 5 μM Yoda1 诱导的细胞内 Ca 的典型痕量2+在 RAW264.7 细胞中含/不含山奈酚的反应 （每个 N = 8）。（C） 来自 （B） 的统计数据 （n = 3）。（D） Ca 的代表性荧光图像2+用 5 μM Yoda1 处理后的 RAW264.7 细胞。（E） 来自 （D） 的荧光图像的统计结果 （n = 4）。
图7 KAE 通过 Piezo1 通道抑制巨噬细胞中的炎症和线粒体氧化损伤。（A） 通过免疫荧光染色（绿色）检测 F4/80 在 BMDMs 中的表达。比例尺，50 μm。（B） 用 100 μg/mL ox-LDL 和山奈酚处理后 BMDMs 中油红色“O”染色的图像。比例尺：50 μm。（C） 来自 （A） 的油红“O”染色的统计结果 （n = 4）。（D） 100 μg/mL ox-LDL 处理后 BMDM 中 IL1b 、 IL6 、 IL10 、 TNFα 和 MCP1 的 mRNA 表达 （n = 4）。（E） Ca 的代表性荧光图像2+100 μg/mL ox-LDL和山奈酚处理后的不同 BMDMs 组中。比例尺，50 μm。（F） 来自 （E） 的荧光图像的统计结果 （n = 4）。（G） 100 μg/mL ox-LDL 处理后 BMDMs 中 DCFH-DA 染色的图像。比例尺：50 μm。（H） 来自 （G） 的 DCFH-DA 染色的统计结果 （n = 4）。
图8 KAE 抑制巨噬细胞炎症，并通过 Piezo1 介导的 MAPK/NF-κB 和 Nrf2/HO-1 信号通路。（A-B）处理后 BMDM 中 Western Blot 对 CD36 的蛋白表达 （n = 3）。（C） 100 μg/mL ox-LDL 处理后不同组 BMDMs 中 CD36 的代表性荧光图像。（D） 来自 （C） 的荧光图像的统计结果 （n = 4）。（E-H）用 100 μg/mL ox-LDL 处理后，Western Blot 在 BMDM 中 ERK 、 p-ERK 、 JNK 、 p-JNK 、 p38 和 p-p38 的蛋白表达 （n = 3）。（I-J）用 100 μg/mL ox-LDL 处理后 BMDM 中 p-p65 和 p65 的蛋白质表达 （n = 3）。（K-M）用 100 μg/mL ox-LDL 处理后 BMDMs 中 HO-1 和 Nrf2 的蛋白表达 （n = 3）。
图9 巨噬细胞 Piezo1 是山奈酚治疗 AS 的分子靶标。（A） 不同 Piezo1 组总主动脉的油红 “O” 染色图像ΔLysM （英语）/ApoE-/-和压电1FL/FL/ApoE-/-小 鼠。比例尺：5 mm。（B） 来自 （A） 的油红“O”染色的统计结果 （n = 4）。（C） ELISA 检测 Piezo1 血清中 MCP-1 的蛋白水平ΔLysM （英语）/ApoE-/-和压电1FL/FL/ApoE-/-（n = 5） 的（D） Piezo1 不同组主动脉 HE 染色图像ΔLysM （英语）/ApoE-/-和压电1FL/FL/ApoE-/-小 鼠。比例尺：200 μm。放大图像，比例尺，50 μm。
结论
本研究结果表明，山奈酚有效缓解 RAW264.7 中 MAPK/NF-κB 的水平并增加 Nrf2/HO-1 的蛋白水平。敲低 Piezo1 后，模型组大鼠 p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38 和 NF-κB p-p65/p65 水平降低，HO-1 和 Nrf2 蛋白表达上调，但山奈酚传导后无显著差异。证明山奈酚通过抑制 Piezo1 通道和 Ca 来调节 CD36 介导的线粒体 ROS 产生2+流入，然后调节 MAPK/NF-κB 和 Nrf2/HO-1 的下游途径，抑制泡沫细胞的形成。此外，为了研究山奈酚泡沫巨噬细胞相关 AS 的抑制是否通过 Piezo1 通道进行调节，本研究使用了具有巨噬细胞特异性 Piezo1 通道条件敲低的小鼠。结果表明，山奈酚通过抑制 Piezo1 通道靶向泡沫状巨噬细胞来改善 AS。
本研究结果表明山奈酚通过抑制巨噬细胞中的炎症和泡沫状细胞减轻 AS，其机制是抑制 Piezo1 通路。研究结果为山奈酚发挥抗 AS 作用的机制提供了新思路，强调了靶向巨噬细胞 Piezo1 离子通道在预防和治疗泡沫细胞形成和 AS 中的治疗意义。
DOI: 10.1016/j.jare.2024.11.016
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