摘要
背景：研究发现酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4 （ACSL4） 的抑制剂，ACSL4 是一种通过铁死亡触发细胞损伤的蛋白质，具有最大限度地减少细胞损伤的潜力。本研究发现了中药中丹皮酚 （PAE） 作为 ACSL4 抑制剂可以预防软骨细胞铁死亡和骨关节炎 （OA）。
方法：本研究使用 PAE 处理的小鼠软骨细胞进行了体外实验，以减轻白细胞介素-1 β （IL-1β） 或柠檬酸铁铵 （FAC） 诱导的铁死亡，检查细胞内铁死亡指标、软骨分解代谢标志物和铁死亡调节蛋白。通过不稳定的内侧半月板 （DMM） 创建小鼠 OA 模型，然后进行关节内 PAE 注射。8 周后，显微计算机断层扫描和组织学评估评估了 PAE 在 OA 模型中的保护和抗铁死亡作用。
结果：体外结果显示，PAE 通过靶向 ACSL4 显着减少 IL-1β/FAC 诱导的损伤，包括细胞凋亡、炎症反应、细胞外基质降解和铁死亡标志物（氧化应激、脂质过氧化和铁积累）。它还恢复了铁死亡抑制因子的表达并减轻了线粒体损伤。此外，PAE 增加了软骨合成代谢标志物的表达，同时降低了软骨分解代谢标志物的表达。分子对接、细胞热转移测定和药物亲和力反应性靶点稳定性分析验证了 PAE 与 ACSL4 之间的结合相互作用。此外，通过 ACSL4 敲低和过表达进一步验证了 PAE 在软骨细胞中的作用。在体内，OA 小鼠表现出软骨降解和铁死亡增加，而关节内 PAE 注射减轻了这些病理变化。
结论：PAE 通过 ACSL4 抑制显着保护原代小鼠软骨细胞和 DMM 手术诱导的 OA 小鼠免受 IL-1β/FAC 诱导的铁死亡。
图文简介
图1. PAE 保护软骨细胞免受 IL-1β/FAC 诱导的增殖抑制和细胞死亡：（A） PAE 结构式（分子式：C9H10O3;分子量：166.17）。（B） 用浓度为 0、12.5、25、50、100 和 200 μM 的 PAE 处理软骨细胞 24 小时（每组 n = 3）。（C） 通过 EdU 染色测定细胞增殖 （比例尺 = 200 μm。（D） 钙黄绿素-AM/PI 双重染色（比例尺 = 200 μm）。（E） EdU 染色荧光强度的半定量分析（每组 n = 3）。（F） PI 染色测定结果的半定量分析（每组 n = 3）。
图 2. PAE 减少 IL-1β/FAC 诱导的炎症、ECM 降解、氧化应激和细胞凋亡：（A∼D） ELISA 用于检测促炎细胞因子 （COX-2、iNOS、IL-6、TNF-α） （每组 n = 3）。（E） ADAMTS5、MMP3、MMP13 和 COX-2 蛋白水平的 Western Blot 分析。（F） 通过条带密度测定法定量蛋白质表达，标准化为 GAPDH （每组 n = 3）。（G） 使用 DCFH-DA 检测细胞内 ROS 并用荧光显微镜观察（比例尺 = 400 μm）。（H） DCFH-DA 荧光强度的定量 （n = 3/组）。（I） 通过 Annexin V-FITC/PI 染色评估细胞凋亡。（J） 细胞凋亡率的定量分析（每组 n = 3）。
图 3. PAE 减轻软骨细胞中 IL-1β/FAC 诱导的铁死亡：（A） ACSL4、SLC7A11 和 GPx4 蛋白水平的 Western Blot 分析。（B） 通过条带密度测定法定量蛋白质表达，标准化为 GAPDH （每组 n = 3）。（C） 使用脂质过氧化 MDA 检测试剂盒测得的 MDA 含量（每组 n = 3）。（D） 铁2+使用 Fe 检测的软骨细胞中的水平2+内容物检测试剂盒（每组 n = 4 个）。（E） 通过 ELISA 测定软骨细胞中的 4-HNE 水平（每组 n = 3）。（F） ELISA 检测的 GPx4 蛋白水平（每组 n = 3）。（G） 细胞内 SOD 活性的测量（每组 n = 4）。（H） 细胞内 GSH、GSSG 含量和 GSH/GSSG（谷胱甘肽氧化还原比）（每组 n = 4）。（I） 谷氨酸和谷氨酰胺水平（每组 n = 3）。（J） 细胞内 Fe2+使用 FerroOrange 使用荧光显微镜（比例尺 = 100 μm）进行可视化。（K） FerroOrange 荧光强度的定量（每组 n = 3）。（L） 软骨细胞的普鲁士蓝染色，红色箭头指示铁沉积（比例尺 = 100 μm）。
图 4. PAE 减轻 IL-1β/FAC 诱导的线粒体损伤：（A） 通过 mtSOX Deep Red 评估并通过荧光显微镜可视化的线粒体氧化应激水平（比例尺 = 100 μm）。（B） 使用罗丹明 123（比例尺 = 100 μm）检测的线粒体膜电位变化。（C） 通过 Mito-Tracker Green 染色评估的线粒体质量（比例尺 = 100 μm）。（D） mtSOX Deep Red 荧光强度的定量（每组 n = 3）。（E） 罗丹明 123 荧光强度的定量 （n = 3/组。（F） Mito-Tracker Green 荧光强度的定量（每组 n = 3）。（G） 通过 TEM 可视化的软骨细胞中的线粒体，红色箭头表示线粒体（比例尺 = 500 nm）。
图 5. PAE 在软骨细胞中表现出与 ACSL4 敲低相当的软骨细胞保护和抗铁死亡作用：（A） PAE 与 ACSL4 的分子对接。ACSL4 蛋白被描绘为石板卡通模型，配体被描绘为青色棒，结合位点被描绘为洋红色棒。省略非极性氢原子。氢键、离子相互作用和疏水相互作用分别用黄色、洋红色和绿色虚线表示。（B） Western Blot 检测 ACSL4 、 ADAMTS5 、 SOX9 和 COL2A1 的蛋白表达水平。（C、D）ACSL4 和 GPx4 的免疫荧光染色（比例尺 = 100 μm）。
图 6.PAE 减轻体内软骨变性：（A） 使用动物的实验设计示意图。使用 Figdraw （https://www.figdraw.com/static/index.html#/） 创建。（B） 通过显微 CT 重建的小鼠膝关节的三维冠状和矢状面图像，红色箭头表示骨赘形成（比例尺 = 1 毫米）。（C） 每组膝关节切片的组织学评估，包括 TB、SOFG 和 H&E 染色（比例尺 = 200 μm）。（D） 每组中关节骨赘的定量 （每组 n = 8）。（E） 每组骨赘成熟度的定量分析 （每组 n = 8）。（F） 每组的改良 Mankin 评分 （n = 8/组）。（G） 四组小鼠的 OARSI 评分 （每组 n = 8）。（H） 四组膝关节软骨厚度的测量 （每组 n = 8）。
图 7.PAE 减轻手术诱导的小鼠 OA 模型中软骨细胞的 ECM 降解和铁死亡：每组关节软骨中 ADAMTS5、 MMP3、 GPx4、 ACSL4 和 4-HNE 的 IHC 测定 （比例尺 = 100 μm），并定量 ADAMTS5、 MMP3 、 GPx4 、 ACSL4 和 4-HNE 的 IHC 分析 （每组 n = 8）。
图 8. PAE 在保护软骨细胞免受铁死亡和通过抑制 ACSL4 减轻 OA 进展中的作用示意图。
结论
本研究证明 PAE 在 OA 进展过程中通过靶向 ACSL4 有效抑制软骨细胞的铁死亡。这一发现丰富了人们对 PAE 抗 OA 的药理机制的理解，并确定了新的治疗靶点，为未来的临床试验奠定了基础。
DOI: 10.1016/j.jot.2024.10.005
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