摘要
黄芪作为中药已有2000多年的历史。其主要活性三萜皂苷黄芪甲苷因其多种健康益处和医学应用而受到广泛关注。尽管如此，黄芪甲苷的生物合成机制仍然未知。本研究发现了一个染色体水平的膜藻基因组组装。鉴定了黄芪甲苷生物合成所需的两种剪裁酶，从而发现了三萜生物合成基因簇，从而阐明了黄芪甲苷的完整生物合成途径。该途径的特点是一系列选择性羟化、环氧化和糖基化反应，这些反应由三个细胞色素p450、一个2-氧戊二酸依赖的双加氧酶和两个糖基转移酶介导。在本氏烟草中这种生物合成机制的重建允许黄芪甲苷IV的异源生产。这些发现为解决与黄芪甲苷来源问题奠定了坚实的基础，并拓宽了我们对萜烯生物合成基因簇多样性的理解。
图文简介
图1 黄芪中结构1及其生物合成途径。a.黄芪的整株和根片。b. 结构1生物合成途径。
图2 AmCYP88D25、AmGT11、AmGT72和AmGT36的功能分析。a，高效液相色谱分析显示6由表达AmCYP88D25的酵母菌CC-4产生。检测紫外波长为202 nm。给出了n = 3个独立实验的代表性结果。b, amcyp88d25催化2生成6。c，萃取离子色谱(EICs) ([M + Na]+ = 513.5±0.5 for 3;[M + Na]+ = 675.5±0.5(7和4)，显示以3和UDP-Glc为底物的三种UGTs (AmGT11, AmGT72和AmGT36)的体外活性。给出了n = 3个独立实验的代表性结果。d, EICs ([M + Na]+ = 513.5±0.5(3)和[M + Na]+ = 645.5±0.5(5))显示以3和UDP-Xyl为底物的两种UGTs (AmGT11和AmGT72)的体外活性。给出了n = 3个独立实验的代表性结果。e, EICs ([M + Na]+ = 645.5±0.5(5)和[M + Na]+ = 807.5±0.5(1))显示以5和UDP-Glc为底物的AmGT36的体外活性。给出了n = 3个独立实验的代表性结果。f, EICs ([M + Na]+ = 675.5±0.5(4)和[M + Na]+ = 807.5±0.5(1))显示以4和UDP-Glc为底物的AmGT11的体外活性。给出了n = 3个独立实验的代表性结果。g、AmGT11和amgt72催化由3生成7。h、AmGT11、AmGT72、AmGT36在形成1中的作用。
图3 BGC参与AG生物合成和基因功能表征。a，包含AG BGC的1号染色体。颜色显示的基因是参与AG生物合成中氧化和糖基化步骤的6个基因(参见补充表12，了解该区域所有基因的详细信息)。在热图中，根据所示的颜色比例，折叠变化相对于每个基因的中位数。b，表达cyp450的菌株CC-4产生的8和9的HPLC分析。检测波长为202 nm;AmCYP88D25的表达(i);AmCYP88D25和AmCYP88D7 (ii);AmCYP88D25和AmCYP71D756 (iii);AmCYP88D25, AmCYP88D7和AmCYP71D756 (iv). n = 3个独立实验的代表性结果如图所示。c，显示benthamiana叶片中AmCYP88D25、AmCYP88D7和AmCYP71D756在体内活性的EICs;AmOSC3和AtCPR1 (i);AmOSC3, AtCPR1, AmCYP88D25, AmCYP88D7和AmCYP71D756 (ii). n = 2个独立实验的代表性结果如图所示。d, EICs显示AmOGD1的体外活性，以12为底物。给出了n = 3个独立实验的代表性结果。e, amogd1介导的生物转化机制。
图4 在本氏烟草中通过瞬时表达重建了完整的1生物合成途径。a, AG BGC和AmOSC3中6个基因编码的所有酶的功能。b，显示benthamiana叶片中AG BGC编码的6种酶的体内活性的EICs;A组(AmOSC3 + AtCPR1)、B组(AmCYP88D25 + AmCYP88D7 + AmCYP71D756 + AmOGD1)和AmGT36、AmGT11的共表达(v);A、B组与AmGT11共表达(iv);A组、B组与AmGT36共表达(iii);A组与B组共表达(ii);(i).图中为n = 2个独立实验的代表性结果。
结论
在本研究中，最初以萜烯合成酶基因(AmOSC3)为诱饵，以基因组为基础探索负责AGs生物合成的BGC的策略并不成功。然而，当将两个下游剪裁基因AmCYP88D5和AmGT11定位到膜拟南芥的染色体中时，发现了一个潜在的AG BGC。其随后的表征导致了1的完整生物合成途径的阐明。一般来说，“特征酶基因”和“剪裁酶基因”是已知萜烯BGCs18的典型成分。然而，在1号染色体上鉴定的AG BGC仅由AG生物合成所需的6个剪裁酶基因组成，而标志酶基因AmOSC3仅位于8号染色体上。有趣的是，考虑到AmOSC3催化的2的形成也与黄芪中甾醇的生物合成有关，AmOSC3从AG BGC中被排除可能是基因组中AGs和甾醇的生物合成之间进化平衡的结果。与这一假设相一致的是，在根中没有观察到AmOSC3的明显组织特异性表达(补充图7)，而ag是在根中生物合成并以最高浓度积累的。值得注意的是，迄今为止鉴定的所有植物BGC的大小在~ 35kb到2mb18,19之间，而含有6个生物合成基因的AG BGC的大小为~ 4mb。AG BGC的结构和大小拓宽了我们对植物萜类BGC基因组组织的认识，为进一步阐明基于BGC的次生代谢产物的生物合成途径奠定了基础。值得注意的是，比较基因组学分析表明，黄芪属植物的AG BGC可能经历了动态进化。通过整合其他黄芪物种和其他豆科植物的基因组序列数据，进一步深入分析植物AG BGC的进化动力学，将为AG生物合成途径的起源和进化提供有价值的见解。
三萜和三萜皂苷是广泛存在的与植物发育和防御反应相关的次生代谢产物，具有巨大的结构多样性。这些化合物还显示出不可估量的生物活性，可用于药物开发。cyp450是一种多功能生物催化剂，在三萜支架的功能化和多样化中起着重要作用。虽然在不同的植物中已经发现了许多修饰三萜的cyp450，但对修饰环artan型三萜的cyp450知之甚少。据我们所知，在CYP85家族中，只有一个属于CYP716家族的CYP450曾被报道催化2的羟基化，尽管氧化的确切位置仍不清楚27。在本研究中，鉴定了三个参与羟基化和环氧化修饰2支架的cyp450。AmCYP88D25和AmCYP88D7被归类为CYP88家族(CYP85家族)的成员;而AmCYP71D756则被归类为CYP71家族(CYP71族)的成员(补充图8)。系统发育相关的同一家族或亚家族中的cyp450通常在底物选择和催化功能方面表现出相似的特征28。因此，鉴定AmCYP88D25、AmCYP88D7和AmCYP71D756对于破译参与其他三萜生物合成的相关cyp450具有重要价值29,30。此外，还发现AG家族成员中的四氢呋喃是AmCYP71D756与2-OGD (AmOGD1)合作的结果。最近的一项研究还发现了两种2- ogd，它们有助于在柠檬酮中形成呋喃环，柠檬酮是另一类主要存在于芸香科和meliaceae中的四环三萜。因此，除了cyp450外，植物似乎还利用了2-OGD家族的成员来氧化和多样化三萜支架。
黄芪在世界范围内被认为是一种有价值的常用药用植物，世界卫生组织关于精选药用植物的专著(第1卷)2指出。黄芪总苷是黄芪的主要活性成分，是一类环artane型三萜皂苷，已被开发为增强免疫力的膳食补充剂和用于抗病毒治疗的商业兽药。事实上，在植物中已经发现了许多具有相同环artane支架的次级代谢物，其中许多具有重要的生物活性和临床用途。然而，目前还没有环artanes的生物合成途径的报道，这些三萜的生产完全依赖于从商业种植设施中提取。这些植物中有许多需要数年才能长到足够大才能收获。通过培养获得生物活性代谢物所需的低产量和大量时间投资限制了它们随后开发成药物。在本研究中，采用基因组学和转录组学分析相结合的方法，全面阐明了黄颡鱼AG的整个生物合成途径。由6个裁剪酶基因组成的萜烯BGC可由2依次转化为1，这是黄芪中主要的活性环artan型三萜皂苷。在本氏烟草中，这种生物合成机制的异源重组允许快速生产和分离1，并且很容易翻译为AG家族的其他成员。我们预计，在本研究中表征的AG BGC不仅有助于通过植物代谢工程和合成生物学开发高效的AG生产平台，而且还将为在植物中发现的其他环ar烷三萜的生物合成途径提供有价值的见解。
DOI: 10.1038/s41477-024-01827-4
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