Advanced Science|银杏素通过直接靶向STING减轻炎症和衰老

据报道，银杏叶提取物对衰老相关疾病有治疗作用。然而，其抗衰老活性的具体成分仍不清楚。本研究发现，银杏仁提取物的一种活性成分银杏素可以缓解衰老小鼠的细胞衰老并改善多种组织的病理。为了揭示银杏素抗衰老作用的分子机制，采用一种基于图卷积网络的药物“on-target”通路预测算法进行预测。结果表明，cGAS-STING 通路可能是 Ginkgetin 的潜在靶点。随后的细胞生物学和生物物理数据证实，银杏素直接与 STING 蛋白的羧基末端结构域结合，从而抑制 STING 激活和信号转导。此外，体内药效学数据显示，银杏素可有效缓解 Trex1 - / - 小鼠的全身炎症，并抑制衰老小鼠模型中异常激活的 STING 信号传导。总之，这项研究利用人工智能算法与药理学方法相结合，证实 STING 是银杏素缓解炎症和衰老的关键靶点。本研究阐明了银杏叶提取物抗衰老作用的特定成分和分子机制，为其治疗用途提供了坚实的理论基础。

图2. 预测并确认 cGAS-STING 通路为 Ginkgetin 的“靶向”通路。A） 将具有蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络的银杏素诱导的特征传递给基于光谱的图卷积网络 （sGCN） 模块以获得潜在向量。Ginkgetin 的 SMILES 被编码到 Morgan 指纹中。然后将潜在向量和 Morgan 指纹串接起来，并将联合向量进一步馈送到深度密集网络以预测 “on-target” 通路。B） 预测 Ginkgetin 的前 10 条“靶向”通路。C，D） THP-1 mφs 与银杏素 （10 μm） 和各种刺激物 （G3-YSD 1 μg mL） 共处理−1、5 μm 时的 cGAMP、2.5 μg mL 的聚 （I：C）−1和 10 μg mL 的 LPS−1） 6 h，用 RT-qPCR 测量 IFNB1 （C） 和 TNF （D） 的 mRNA 表达水平。E-G） 用银杏素 （10 μm） 和各种刺激物 （ISD 为 1 μg mL） 共处理 Raw 264.7 细胞−1、5 μm 时的 cGAMP、2.5 μg mL 的聚 （I：C）−1和 10 μg mL 的 LPS−1） 6 h，RT-qPCR 检测 Ifnb1 （E） 、 Il6 （F） 和 Cxcl10 （G） mRNA 表达水平。H，I） PP 检测银杏素对人 cGAS （hcGAS） （H） 和小鼠 cGAS （mcGAS） （I） 酶活性的抑制作用我ase 偶联 cGAS 活性测定。J） 用不同浓度的银杏素处理过表达 STING 、 TBK1 或 IRF3-5D 的 293T 细胞 6 h，RT-qPCR 检测 IFNB1 的 mRNA 表达水平。K） cGAS-STING 通路示意图。

图3. Ginkgetin 直接与 STING 的羧基末端结构域结合。A） 银杏素对各种 STING 蛋白热稳定性的影响总结。B） hSTING 的熔融曲线WT和 mSTINGWT在 PTS 测定中用不同剂量的 Ginkgetin 处理的蛋白质。C） hSTING 的熔融曲线编号 N154S和 hSTINGV155M 系列在 PTS 测定中用不同剂量的 Ginkgetin 处理的蛋白质。D，E） Ginkgetin 与 hSTING 的动力学结合谱WT蛋白 （D） 和 mSTINGWT通过 SPR 测定分析蛋白质 （E）。KD使用 1：1 动力学结合模型确定值。F） 滴定 hSTING 的 Ginkgetin 的 ITC 结合曲线WT.左上图表示原始 ITC 热图，左下图表示拟合的结合等温线。右图显示了该期间的 ΔG、ΔH 和 -TΔS。G） Ginkgetin 和 cGAMP 结合 hSTING 竞争的 HTRF 分析曲线WT蛋白。

图4. Ginkgetin 抑制 STING 激活和信号转导。A） 在 5 μm cGAMP 存在下，THP-1 mφs 中的 SEAP（分泌型碱性磷酸酶）活性和 Raw-Lucia 细胞中的荧光素酶活性 24 小时。B） 用不同浓度的银杏素处理 24 小时的 THP-1 mφs 和 Raw 264.7 细胞的细胞活力。C，D） 用指定化合物处理 6 小时的 THP-1 mφs 的转录组学分析。cGAMP 在 5 μm 处使用，银杏素在 10 μm 处使用。与 cGAMP 组相比，银杏素和 cGAMP 共处理组中最显着下调的 50 个基因由热图 （C） 表示。两组之间的差异基因由火山图 （D） 表示。E，F） 用银杏素和 cGAMP 共处理 2 h 的 THP-1 mφs （E） 和 Raw 264.7 （F） 细胞中 cGAS-STING 通路中关键蛋白磷酸化水平的蛋白质印迹分析。G，H） 使用共聚焦显微镜对 THP-1 mφs 中的 IRF3 （G） 或 p65 （H） 进行免疫荧光成像。THP-1 mφs 用 10 μm 银杏素或 DMSO 预处理，然后用 5 μm cGAMP 刺激 2 h。比例尺，20 μm。I） 在 293T 细胞中使用抗 Myc 珠子（上图）或抗 Flag 珠子（下图）进行免疫共沉淀以检测 STING 和 TBK1 之间的相互作用。用 Flag-STING 和 Myc-TBK1 质粒转染细胞 24 h，然后用 10 μm Ginkgetin 和 5 μm cGAMP 共处理 2 h。J，K） 使用共聚焦显微镜对 HeLa 细胞中 TBK1 的 STING （J） 或带有 GM130 （高尔基体自身抗原） （K） 的 STING 进行免疫荧光成像。用 Flag-STING 质粒转染 24 小时后，用 10 μm 银杏素或 DMSO 处理细胞，随后用 5 μm cGAMP 或 1 μm GSK3 刺激 2 小时。

图5. 银杏素抑制 Trex1 中的全身炎症−/−小 鼠。A） RT-qPCR 检测 BMDMs 中 Ifnb1 、 Cxcl10 、 Isg15 、 Isg56 、 Il6 和 Il1b 的 mRNA 水平。BMDMs 来源于 Trex1−/−或 WT 小鼠并用 10 μm 银杏素处理 24 小时。BD） Trex1−/−WT 小鼠用 Vehicle 或 5 mg kg 腹膜内处理−1银杏素溶于含有 DMSO、PEG400 和 10% 羟丙基-β-环糊精的水溶液中（5/5/90，v/v/v），每 2 天一次，持续 20 天 （n = 6）。在实验终点，收集并分析心脏、肝脏、肾脏、胃、舌和肌肉。显示了小鼠的生存曲线 （B）。通过 RT-qPCR 检测各种器官和组织中指示基因的 mRNA 水平 （C）。显示了各种器官和组织中 H&E 染色的图像及其盲法组织学评分。比例尺，200 μm （D）。

图6. 银杏素通过抑制 cGAS-STING 通路发挥抗衰老活性。A-C） 从 TBI 诱导的衰老小鼠模型获得肾脏 （A）、肝脏 （B） 和肺 （C） 组织，随后用抗 p-STING （Ser365）、p-TBK1 （Ser172）、p-IRF3 （Ser396）、p-p65 （Ser536） 和 p-STAT3 （Tyr705） 的抗体染色。显示了代表性图像，比例尺代表 50 μm。还显示了定量分析结果。

结论

本研究采用基于图卷积网络的药物“靶向”路径预测算法进行预测。结果表明，cGAS-STING途径可能是Ginkgetin的潜在靶点。随后的细胞生物学和生物物理数据证实，Ginkgetin直接与 STING 蛋白的羧基末端结构域结合，从而抑制STING激活和信号转导。此外，体内药效学数据表明，Ginkgetin可有效缓解Trex1 −/−小鼠的全身炎症，并抑制衰老小鼠模型中异常激活的 STING 信号传导。综上所述，本研究利用人工智能算法结合药理学方法，证实STING是银杏素缓解炎症和衰老的关键靶点。重要的是，本研究阐明了银杏叶提取物抗衰老作用的具体成分和分子机制，为其治疗用途提供了坚实的理论基础。