Redox Biology|橄榄苦苷、羟基酪醇、油棘醛及其组合的心脏保护潜力：揭示对急性心肌梗死和代谢综合征的互补作用

临床研究先前已经确定了橄榄产品在心血管疾病(CVD)预防中的作用，而确定有益效果的负责成分仍有待确定。我们试图评估和比较橄榄苦苷(OL)、羟基酪醇(HT)、油籽酸(OC)和齐墩果酸(OA)在缺血/再灌注损伤(IRI)和CVD危险因素缓解方面的心脏保护潜力。该研究的范围是为高心血管风险患者设计一种有效且安全的联合治疗方法。我们在健康和代谢综合征(MS)负荷小鼠中评估了营养剂量的OL、HT、OC或OA治疗6周的iri限制潜力。设计了三种组合方案，与分离的化合物相比，具有优势优势的混合物(OL-HT-OC, Combo 2)，包括梗死减少和降糖能力，进一步研究其抗动脉粥样硬化作用。体内实验显示，Combo 2联合治疗方案在限制梗死面积和高血糖方面效果最佳，我们选择Combo 2联合治疗方案在慢性冠状动脉综合征(CCAS)患者的临床环境中进行进一步研究。在临床研究中，在基线和使用OL-HT-OC补充剂治疗4周后评估心功能、炎症标志物和氧化应激。我们发现，与对照组相比，OL、OC和OA显著降低了体内梗死面积。OL具有抗高血糖的特性，OA可减轻高胆固醇血症。OL-HT-OA、OL-HT-OC和OLHT-OC-OA联合治疗方案具有心脏保护作用，而只有OL-HT-OC能减轻高血糖。Combo 2的心脏保护作用归因于细胞凋亡的抑制、抗氧化作用的增强和抗氧化酶的上调。此外，它还能减少体内动脉粥样硬化斑块的范围。在小规模的临床研究中，OL-HT-OC补充剂改善了心脏、血管和内皮功能。总之，OL-HT-OC联合治疗在体内具有有效的心脏保护、降糖和抗动脉粥样硬化特性，对高危患者具有显著的临床可转化的心血管益处。

图2 橄榄苦苷减轻高血糖并增加血浆中的胰岛素水平。a的图形。ns -、OL-和ht处理小鼠的空腹血糖。B. DMSO 5%-、OC-和oa处理小鼠的空腹血糖。C.第14周空腹血浆胰岛素水平。D.计算HOMAIR指数。E.所有治疗组和ND组的血糖曲线。F.计算每条葡萄糖曲线下面积，包括ND组。A, B双向方差分析，Tukey事后检验。C, D, F，单因素方差分析，Tukey事后检验。++p <0.01 vs Veh (DMSO 5%)， ###p < 0.001 vs HT， *p < 0.05， **p <0.01，  p<0.01 vs ND，p<0.0001 vs ND。所有数值均以Mean±SEM表示(n = 5-13)。DMSO:二甲基亚砜;HT:羟基酪醇;ND:正常饮食;OA:齐墩果酸;OC:油甘油酯;橄榄苦苷。

图3 齐墩果酸能降低总胆固醇，但没有一种治疗方法能减轻肥胖。a的图形。ns -、OL-和ht处理小鼠的总胆固醇和甘油三酯水平(mg/dl)。B. 5%-、OC-和oa处理小鼠的总胆固醇和甘油三酯水平(mg/dl)。C. NS、OL、HT处理小鼠体重。D. 5% DMSO、OC、OA处理小鼠体重。E. NS、OL、HT处理小鼠尿膜脂肪组织的相对重量。F. 5% DMSO、OC、OA处理小鼠尿膜脂肪组织的相对重量。A, B, C, D双向方差分析，Tukey事后检验。E, F单因素方差分析，Tukey事后检验。*p < 0.05， ***p < 0.001。所有数值均以Mean±SEM表示(n = 5-14)。HT:羟基酪醇;ND:正常饮食;OA:齐墩果酸;OC:油甘油酯;橄榄苦苷。

图4 联合治疗1、2和3显著减少梗死面积的程度与保护心脏的橄榄苦苷、油甘油酯和齐墩果酸相似。a的图形。梗死/危险面积比%和B.危险面积%的小鼠联合治疗或DMSO 5%。C.用分离的化合物或组合治疗的所有小鼠的梗死/危险面积比%和D.危险面积%。A, B, C, D，单因素方差分析，Tukey事后检验。**p < 0.01， **p < 0.001， ****p < 0.0001。所有数值均以Mean±SEM表示(n = 6-11)。DMSO:二甲基亚砜;HT:羟基酪醇;ND:正常饮食;OA:齐墩果酸;OC:油甘油酯;橄榄苦苷。

图5 Combo 2 (OL、HT、OC)降低空腹血糖水平，增加血浆胰岛素，对高胆固醇血症和肥胖无显著影响。A. 5% DMSO -、Combo 1-、Combo 2和Combo 3治疗小鼠的空腹血糖图。B.第14周空腹血浆胰岛素水平。C.计算HOMAIR指数。D.葡萄糖曲线。E.每条葡萄糖曲线下的计算面积。F. dmso 5%-、Combo 1-、Combo 2-和Combo 3-处理小鼠的体重。G.相对脂肪组织重量。H.血浆中总胆固醇和甘油三酯。A, F, H双向方差分析，Tukey事后检验。B, C, E, G单因素方差分析，Tukey事后检验。##p < 0.01， ####p <0.0001与基线相比，$p < 0.05， $p < 0.01， $$p < 0.001， $$$$p <0.0001与8周相比，p<0.0001与ND相比，*p < 0.05， **p < 0.01所有数值均以Mean±SEM表示(n = 5-11)。DMSO:二甲基亚砜;组合1:OL, HT, OA;Combo2: OL, HT, OC;组合3:OL, HT, OC, OA。

图6 橄榄苦苷、油橄榄醇和Combo 2可降低Bax/BcL-xL的凋亡比例，油橄榄醇和Combo 2可上调Nrf2水平和抗氧化酶MnSOD和CAT。A.再灌注2 h时cat、GAPDH、Bax、BcL-xL、α- actitin、p-Akt (S473)、t-Akt、HO-1、p-GSK-3β (S9)、t-GSK-3β和MnSOD的代表性印迹。B.代表性的Nrf2、gp91phox、p47phox、NOX-1和β-微管蛋白再灌注2小时的印迹。归一化后C. Bax/GAPDH总蛋白的相对密度图。D. BcL-xL/GAPDH;E. Bax/BcL-xL。F. p-GSK-3β (S9)/t-GSK-3β。G. t-GSK-3β/α- actitin。H. p-Akt (S473)/t-Akt。1 . t-Akt/ α- actitin。J. MnSOD/a- actiin;K. cat / gapdh。L. HO-1/α- actiin;M. Nrf2/β-微管蛋白，N. NOX-1/β-微管蛋白，O. gp91phox/β-微管蛋白，P. p47phox/β-微管蛋白。D, E, F, G, H, I, J, K, L，单因素方差分析，Tukey事后检验。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。所有数值均以Mean±SEM表示(n = 6-8)。Akt:蛋白激酶B;Bax: BCL2 Associated X;Bcl-xL:超大型b细胞淋巴瘤;CAT:过氧化氢酶;方案2:OL、HT、OC联合治疗;DMSO:二甲基亚砜;甘油醛-3-磷酸脱氢酶;HO-1:血红素加氧酶1;HT:羟基酪醇;锰过氧化物歧化酶;ND:正常饮食;NOX -1: NADPH氧化酶1,Nrf2:核因子红系2相关因子2;OC:油酸;橄榄苦苷。

图7 羟基酪醇和油烛醇在体外限制NETosis，而羟基酪醇、油烛醇和Combo 2在体内可显著降低动脉粥样硬化病变程度和氧化应激。a、B.荧光显微镜下分离的化合物及其组合对中性粒细胞MPO释放的影响，有或没有PMA激活，C .各处理的净毒性相对定量。D.明视显微镜下用Oil Red O染色的ApoE−/−主动脉切片(尺度为150 μm)和E.经OL、HT、OC或Combo 2治疗4周后ApoE−/−小鼠主动脉环Oil Red O (ORO)密度测定(占总主动脉面积的百分比)。F.各实验组经OL、HT、OC或Combo 2治疗4周后，用DHE和DAPI染色确定活性氧形成的主动脉段代表性图像(刻度为75μМ)和E.柱状图，用相对荧光强度量化DHE/DAPI。h的条形图。预处理4周后，apoe−/−小鼠循环中的MDA和I. ox-LDL和J.血浆总胆固醇。E, G, H, I, J，单因素方差分析。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。所有数值均以Mean±SEM表示(体内实验n = 5-6，体外实验n = 3个生物重复)。方案2:OL、HT、OC联合治疗;DAPI: 49,6-二氨基-2-苯基吲哚;DHE:二氢乙锭DMSO;二甲基亚砜;HT:羟基酪醇;LDL:低密度脂蛋白;丙二醛:丙二醛;OL:橄榄苦苷;ORO:油红O;TBARs:硫代巴比妥酸反应物质。(读者可参阅本文的网页版本，以了解该图例中有关颜色的解释。)

结论

总之，本研究设计了一种组合治疗方法，由营养剂量的橄榄衍生生物活性化合物组成，它对IRI和动脉粥样硬化斑块的形成具有有效的保护作用，并具有抗高血糖作用。此外，本研究为在未来的临床前和临床研究中研究油棘酸作为一种新的心脏保护化合物提供了第一个证据。目前，多发性硬化症的治疗主要依赖于生活方式和饮食的改变，如果结果不充分，可能需要针对每个单独的风险因素进行特定的药物治疗，这大大增加了主要心血管事件和死亡率的风险。在预防策略方面，本研究为具有危险因素的患者提供了新的转化数据，为橄榄成分和产品作为辅助营养品对抗复杂的心脏代谢综合征和IRI铺平了道路。