Biofabrication|一种负载没食子儿茶素和白藜芦醇的天然水凝胶用于止血、抗菌和抗炎紧急伤口治疗

急诊伤口往往伴随着细菌感染、氧化应激，以及由于无法快速闭合和止血而产生的过度炎症，导致慢性伤口难以愈合。在临床上，手术缝合是最快的伤口愈合方法26，但它只适用于出血量小且会造成难看疤痕的伤口。因此，迫切需要一种多功能的止血敷料来处理各种复杂的伤口，特别是在紧急情况下。在这项研究中，我们构建了一种独特的多功能天然明胶基水凝胶，具有止血、抗菌和抗炎症的特性。该水凝胶由4-(4-(羟甲基)-2-甲氧基-531硝基苯氧基)丁基乙二胺修饰的甲基丙烯酸明胶(GelMA-NB)和32表没食子儿茶素没食子酸酯接枝的聚lysine (EPL-EGCG)组成，具有良好的粘附、抗菌和抗氧化性能。同时，水凝胶上装载了包裹天然白藜芦醇的GelMA 34微球(RES@GM)。在36种不同的动物模型中，水凝胶均表现出良好的止血和伤口愈合效果。下调IL-1β的表达，促进炎症调节和潜在的血管生成和抗疤痕。综上所述，独特的多用途天然明胶基水凝胶适用于各种复杂伤口，为紧急伤口敷料的应用提供了一种很有前景的策略。

图1 水凝胶和微球的物理化学性质。不同比例(6%GelMA-NB、8%GelMA-NB、10%GelMA-NB和8%GelMA-NB/ 1l - egcg)凝胶的流变行为。水凝胶的存储模量(G’)和损耗模量725 (G’)分别随时间(A)和频率(B)绘制，并分别以实心和空心符号表示。C)不同比例下GelMA-NB/EPL-EGCG水凝胶的应力-应变曲线。D)冷冻干燥后水凝胶的表面形貌。标尺:100 μm。不同比例GelMA729 NB/EPL-EGCG水凝胶的溶胀728曲线(E)、降解曲线(F)和交联拉伸粘附强度统计(G)。H) RES@GM微球的SEM图像。刻度730 bar: 3 μm。I)不同组成的GelMA-NB水凝胶的混凝指数(对照，GelMA-NB, GelMA-NB/RES@GM, GelMA-NB/EPL-EGCG/ RES@GM)。

图2 水凝胶和微球的体外生物相容性。A)不同734浓度RES@GM(10、50、100、200、500、1000 μg/mL)孵育24小时后的细胞毒性试验。B)不同水凝胶(GelMA-NB, GelMA-NB/EPL737 EGCG, GelMA-NB/RES@GM, GelMA-NB/EPL-EGCG/RES@GM)孵育1 -3天后的细胞毒性试验。C)不同水凝胶提取物孵育 (AM:绿色，PI:红色，比尺=100μm)的活染色和死染色图像。D)不同水凝胶提取物孵育后的细胞骨架染色图像(DAPI:蓝色，phalloidin:红色，比尺=100μm)。

图3。水凝胶清除活性氧和促进M2极化的体外评价。A) 不同水凝胶(GelMA-NB, GelMA-NB/EPL-EGCG, GelMA-NB/RES@GM和GelMA-NB/EPL-EGCG/RES@GM)处理细胞在0，6和24小时的迁移图(标尺:100 μm)。B)细胞迁移率统计图。C)不同水凝胶处理24h后细胞内活性氧清除的荧光染色图(DCFH-DA:绿色，条长:100 μm)。D)活性氧清除的定量荧光强度。E) 不同水凝胶作用RAW264.7 24h后，流式细胞术检测M1 (CD86+)和M2 (CD206+)的表达情况。F)定量统计RAW264.7细胞中M1 (CD86+)和M2  (CD206+)的表达及M1/M2的比例。G) Western blot检测不同水凝胶处理细胞中CD206 的表达。H) western blot检测CD206/GAPDH 的定量统计。

图 4. 体外抗菌评价。A) 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落琼脂平板图像；B) 抗菌率的定量统计。C) 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的 SYTO9/PI 荧光染色（SYTO9： 绿色，PI：红色，比例尺： 50 μm）。D) 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的扫描电镜图像（比例尺：1 μm）。

图5 评估水凝胶对体内伤口愈合的促进作用。A) 不同水凝胶（GelMA-NB、GelMA-NB/EPL-EGCG、GelMA NB/RES@GM 和 GelMA-NB/EPL-EGCG/RES@GM）在不同时间点（-1、3、7、10 和 14 天）处理伤口的观察结果。B) 不同水凝胶伤口愈合率的定量统计。C) 不同水凝胶处理的伤口组织的 H&E 染色图像（比例尺：500 μm）。D) 使用不同水凝胶处理的伤口组织的 Masson 染色图像（比例尺：500 μm）。

图6 体内水凝胶处理后皮肤组织中巨噬细胞表型和血管化评估。A) 处理 3 天和 7 天后 CD206 的免疫荧光图像（CD206：红色，DAPI：蓝色，比例尺：200 μm）；B) 定量统计。C) 第 7 天炎性因子 IL-1β、TNF-α 和 IL-10 的免疫组化图像（比例尺：100 μm）和 D) 阳性率统计值。E) 处理 3 天和 7 天后 CD31 和 α-SMA 的免疫荧光图像（CD31：红色，α SMA：绿色，DAPI：蓝色，比例尺：200 μm）和 F) 血管密度的定量统计。G）治疗 3 天和 7 天后 VEGF 的免疫组化图像；H）定量统计。I) 第 14 天 FAK 和 PI3K 的免疫组化图像（比例尺：100 μm）和 J) 阳性率统计。

图7 评估水凝胶在体内的止血和切口愈合效果。A) 尾部出血量和止血时间。B) 肝出血量和止血时间。C) 伤口大体图像，D) H&E 染色（比例尺：500 μm），E) Masson 染色图像（比例尺：500 μm），F) 炎症因子 IL-1β、TNF-α 和 IL-10 的免疫组化图像（比例尺：200 μm），G ) 使用不同材料治疗后第 7 天和第 14 天免疫组化阳性率的统计值。

结论

尽管临床实践中有许多有效的止血技术，目前止血技术局限性和大出血仍面临挑战。除了大出血之外，伤口还伴有细菌感染、氧化应激和过度炎症，导致伤口慢性化，难以愈合。手术缝合是缝合伤口最快的方法，但只适用于出血量较小的伤口。易留疤，且在紧急情况下不能随时使用。商用伤口粘合剂毒性低，不会降解，也不会引起过敏。本研究利用 NB 对 GelMA 进行改性，制备出具有可调机械性能的 GelMA-NB 水凝胶。接着，本研究通过酰胺反应将 EPL 接枝到 EGCG 二聚体上。结果表明，EPL-EGCG 的加入大大提高了水凝胶的韧性和溶胀性能。此外，抗菌测试结果表明，添加 EPL-EGCG 还为水凝胶带来了优异的体外广谱抗菌性能。实验结果表明，GelMA  NB/EPL-EGCG/RES@GM 水凝胶在体外具有优异的抗凝、抗炎和抗氧化特性。在大鼠尾静脉出血模型和肝脏出血模型中，GelMA-NB/EPL-EGCG/RES@GM 水凝胶表现出优异的凝血性能。 在大鼠伤口感染模型中，多功能抗炎止血水凝胶促进了伤口的快速闭合，并下调了IL-1β，促进了M2巨噬细胞的极化。同时，水凝胶的 炎症调节作用还能促进血管生成，减少瘢痕形成。在大鼠切口模型中，多功能抗炎止血水凝胶促进了伤口的快速闭合，调节了炎症并减少了疤痕。GelMA-NB/EPL-EGCG/RES@GM 水凝胶在不同动物模型 中的显著实验结果表明，该水凝胶具有适应不同类型复杂伤口的潜力。总之，这种独特的多功能抗炎止血水凝胶为临床和日常伤口敷料的开发提供了一种前景广阔的策略。