Carbohydrate Polymers|黄芪多糖纳米粒复合微针通过抑制ROS/ NF-κB通路调节巨噬细胞极化促进创面愈合

慢性糖尿病伤口的愈合在现代仍然是一个巨大的挑战。本研究根据创面的生理特点，设计了一种具有止血、抗炎、抗氧化、抗菌、诱导血管生成等作用的新型中药微针贴片。最初，具有止血性能白色多糖（BSP）和具有抗菌性能的羧甲基壳聚糖（CMCS）被用作微针制造的材料。使其具有抗菌、促凝血和粘附特性。其中，以黄芩（SB）和黄连（CC）药物中的有效成分黄芩素（Bai）和小檗碱（Ber）为基础，负载了ROS敏感性黄芪多糖（APS）纳米粒（APB@Ber）。将它们共同构建成多功能中药复合微针（C/B@APB@Ber）。Bai和Ber协同发挥抗炎和抗微生物作用。载BSP和APS的微针贴片对细胞增殖和血管生成诱导具有显著作用。复合多糖的组合使得微针能够稳定地粘附于伤口，并提供足够的强度以穿透生物膜并诱导分散。复合多糖的组合使得微针能够稳定地粘附于伤口，并提供足够的强度以穿透生物膜并诱导分散。因此，中药多功能微针贴剂在促进糖尿病创面愈合方面具有潜在的医学价值。

图1.促进伤口愈合的APB@ Ber-MNs贴片的示意图。(a)C/B@APB@Ber-MNs贴片的合成工艺图。(b)MNs插入后，微环境敏感，实现了药物的缓释，减少了氧化应激损伤。(c)MNs系统的杀菌、抗炎和血管生成愈合机制。

图2.APB和APB@Ber的表征。(a)APB@Ber的粒度分布和（B）通过DLS测定的APB和APB@Ber的Zeta电位。(c)APB@Ber的TEM图像，尺度为100 nm。(d)APB的CMC特征。(e)APB@Ber在72 h内的粒度和PDI变化。(f)在不同H2 O2浓度（0 mM、0.5 mM和1 mM）下，Ber从APB@Ber的累积释放。通过单因素ANOVA（n = 3）评估统计学显著性。

图3. APB的体外细胞实验。(a)在不同时间点（0.5小时、1小时、2小时、4小时）HUVEC中的游离Ce 6和APB@Ce6的摄取。比例尺= 100 μm。(b)使用ImageJ对游离Ce 6和APB@Ce6的摄取进行荧光定量。(c)APB@NR在不同时间点（1 h、2 h、4 h和6 h）的药物释放行为。比例尺= 100 μm。(d)在NR释放时APB的ImageJ荧光定量。(e)APB和APB@Ber在24小时后在HUVEC细胞中的增殖活性。(f)24小时后，APB和APB@Ber在L929细胞中的增殖活性。通过单因素ANOVA（n = 3）评估统计学显著性。P值：**P < 0.01，*P < 0.0001。

图4.MNs的表征。（a）和（b）C/B@APB@ Ber-MN的光学显微镜图像。(c)和（d）C/B@APB@ Ber-MN的SEM图像。（e）不同微针组的FTIR。(f)不同MNs组的凝血活性。(g)不同MNs组的力学性能。(h)C/B@APB@ BerMN插入后的皮肤HE图像。(i)皮肤插入后不同时间点C/B@APB@ Ber-MN的溶出度图像。使用单因素ANOVA（n = 3）评估统计学显著性。P值：**P < 0.01，*P < 0.001，*P < 0.0001。

图5.MNS的体外抗氧化和抗菌能力：（a）各MN基团清除DPPH自由基的能力。(b)各MN组清除ABTS自由基的能力。(c)和（d）与ROS的共培养图像和使用ImageJ对每个MN组的定量分析。比例尺= 100 um。(e)和（f）与JC-1的共培养图像和使用ImageJ对每个MN组的绿色荧光的定量分析。比例尺= 100 μm。(g)、（h）和（i）表示不同浓度的C/B@APB@Ber-MNs与E.coli和S.aureus）具有良好的抗菌活性。通过单因素方差分析确定统计学显著性（n = 3）。P值：**P < 0.01，*P < 0.0001。

图6.MNs的生物相容性和细胞迁移。(a)在1、3和5天后，各MNs组对L929细胞的细胞毒性。比例尺= 100 μm。(b)各MNs组的血液相容性（i：阴性ii：阳性iii：C-MNs iv：C/B-MNs v：C/B@APB-MNs vi：C/B@APB@Ber-MNs）。(c)分析各组的溶血率。(d)在1、3和5天后使用CCK-8进行的L929细胞的增殖测定。(e)18小时后HUVEC细胞的迁移。比例尺= 100 μm。(f)18小时后L929细胞的迁移。比例尺= 100 μm。(g)18小时后HUVEC细胞和L929细胞的迁移率。(h)（i）和（j）6小时后HUVEC细胞的血管形成和定量分析。比例尺= 100 μm。通过单因素方差分析确定统计学显著性（n = 3）。P值：*P < 0.001，*P < 0.0001。

图7.MNs的免疫调节和抗菌活性。VEGF调节与MNs的免疫调节。(a)和（B）在不同组的MNs与HUVEC细胞共培养后，VEGF的免疫荧光染色和ImageJ荧光定量。比例尺= 100 um。(c)和（d）在不同组的MN与HUVEC细胞共培养后VEGF的蛋白表达和定量。(e)各组MNs与RAW264.7细胞共培养后CD 86和CD 206的免疫荧光染色。比例尺= 100 um。(f)细胞上清液中的IL-6值。(g)细胞上清液中的TNF-α值。(h)用不同组MN处理的LPS活化RAW264.7细胞中IκB、p65、p-IκB和p-p65条带的蛋白质免疫印迹分析。GAPDH用作上样对照。通过单因素方差分析确定统计学显著性（n = 3）。P值：*P < 0.05，**P < 0.01，*P < 0.001，*P < 0.0001。

图8.MNs在糖尿病大鼠伤口中的应用。(a)在第0，3，7，12天，每个MNs组的伤口闭合图像。比例尺= 5mm（B）不同组愈合过程中的平均伤口面积。（d）在不同组MN中，在3天和7天时用感染性糖尿病治疗的小鼠的细菌菌落。(e)12天后各组HE染色。比例尺= 100 μm。(f)和（c）12天后不同组的Masson染色和ImageJ定量。通过单因素方差分析计算统计学显著性（n = 5）。P值：*P < 0.0001。

图9.MN的免疫组织化学和生物相容性（a）IL-6、（B）TNF-α和（c）VEGF的免疫染色。此外，（d）IL-6、（e）TNF-α和（f）VEGF的相对表达。比例尺= 100 μm。通过单因素方差分析计算统计学显著性（n = 5）。P值：*P < 0.05，**P < 0.01，*P < 0.0001。

综上所述，本研究开发了一种基于中药有效成分的多功能给药系统。中药多糖BSP和APS的包合显著促进细胞增殖和新血管的生成。黄芩-黄连药对的主要活性成分白和白柏的协同使用可以有效地显示抗菌、抗氧化和免疫调节作用。将Bai和Ber制备成ROS响应性纳米颗粒。它能在伤口高ROS的病理环境中响应药物的释放，不仅解决了两者溶解性差的问题，而且提高了它们的生物利用度。所制备的微针组C/B@ AP B @Ber具有抗菌、免疫调节、抗氧化和促进新生血管生成的作用，能够满足感染性糖尿病创面愈合的需要。因此，所制备的多功能中药MN贴片表现出优异的生物相容性，解决抗生素耐药性，并在促进糖尿病伤口愈合方面显示出显著的潜力。