摘要
新出现的证据表明大麻素在阿尔茨海默病(AD)中的治疗潜力，但大麻素如何影响大脑认知和AD病理的潜在机制尚不清楚。本研究表明，慢性大麻二酚(CBD)给药可显著减轻5×FAD AD小鼠模型的认知缺陷和海马β-淀粉样蛋白(Aβ)病理。CBD主要通过增强海马齿状回(DG)中抑制性突触外甘氨酸受体(GlyR)的功能来实现其疗效。体外和体内电生理记录及钙显像显示，CBD通过GlyR介导的抗AD作用主要是通过降低AD小鼠DG颗粒细胞的神经元亢进来实现的。此外，aav介导的DG GlyRα1的消融，或GlyRα1S296A突变专门破坏CBD的结合，显著阻断了CBD的抗ad作用。这些发现表明，在治疗AD的CBD治疗潜力的GlyR依赖机制。
图文简介
图1慢性给药CBD对AD患者认知功能的影响。图示CBD给药时间和行为测试程序。b NOR测试原理图。c接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD小鼠在新目标区花费的时间(左)和行进距离(右)的百分比。在BM试验中，接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD小鼠在训练阶段(d)的代表性痕迹(左)、逃避潜伏期(右)和探针测试(e)。f 在MWM试验中，接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD小鼠在训练过程中的代表性痕迹(左)和逃避潜伏期(右)。g 接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD小鼠在探针测试中目标象限和其他三个象限(相对、右、左)的时间。h接受慢性Veh或CBD治疗的5倍FAD小鼠训练时的平均速度。慢性Veh或CBD治疗对5× FAD小鼠AR潜伏期的影响。j 在of试验中接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD小鼠的代表性轨迹。5× FAD小鼠接受慢性Veh或CBD治疗后的中心时区时间(k)和进入时间(l)。慢性Veh或CBD治疗5× FAD小鼠的中心区距离(m)和总距离(n)。
图2 慢性CBD给药对AD患者Aβ病理的影响。a, b接受慢性Veh或CBD治疗的WT和5x FAD小鼠脑内a β斑块的代表性图像(蓝色，DAPI;红色为β斑块)。比例尺，500 μm。c接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD小鼠全脑内Aβ斑块的定量。d接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD小鼠海马中Aβ斑块的代表性图像和定量。标尺，100 μm。每组N = 6只。DG中β斑块减少百分比与NOR、BM和MWM试验中认知改善的相关性分析。h接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD小鼠DG中斑块化的代表性图像和定量。标尺，50 μm。在NOR、BM和MWM试验中，小尺寸β斑块(直径1-5 μm)减少百分比与认知改善的i-k相关性分析。l接受急性Veh或CBD治疗的5× FAD小鼠DG中斑块化的代表性图像和定量。标尺，50 μm。列中的每个点表示一个已测试的鼠标。
图3 GlyR在CBD介导的抗ad作用中的特征。DG颗粒细胞中IGly (a)和Itonic (c)的电生理记录示意图。GC:颗粒细胞。慢性Veh或CBD治疗5× FAD小鼠DG切片中IGly (b)和Itonic (d)有代表性的微量记录和平均值。甘氨酸(Gly)在100 μM，士的宁(Stry)在1 μM。N =每组12-15个细胞。e 5× FAD:GlyR / 1flox/flox小鼠DG注射AAV-Cre-EGFP示意图。f 5× FAD:GlyR / 1flox/flox小鼠全脑EGFP+和Aβ斑块信号的代表性图像(蓝色，DAPI;绿色，EGFP;红色:β斑块)。标尺，500 μm。g表达AAV-EGFP或AAV-Cre-EGFP的5× FAD:GlyR ø 1flox/flox小鼠DG中GlyR ø 1mrna的定量表达。每组N = 7只。CT:对照组注射AAV-EGFP。接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD::GlyR / 1flox/flox小鼠在新目标区花费的时间百分比(h)和行进的距离百分比(i)。每组N = 7只。j接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD:GlyR / 1flox/flox小鼠在BM试验中训练期和探针试验的逃避潜伏期平均值。每组N = 7只。k在MWM实验中，接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD:GlyR / 1flox/flox小鼠在训练阶段和探针测试中的逃避潜伏期平均值。每组N = 7只。l接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD:GlyR / 1flox/flox小鼠DG中Aβ斑块的代表性图像和定量。标尺，100 μm。每组N = 7只。m接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD:GlyR / 1flox/flox小鼠DG中斑状Aβ斑块的代表性图像和定量。标尺，50 μm。
图4 GlyR r 1 S296A突变对CBD介导的抗ad作用的影响。a 5× FAD:GlyR * 1S296A小鼠的生成示意图。慢性Veh或CBD治疗5× FAD::GlyR [1S296A]小鼠DG切片中IGly (b)和Itonic (c)的代表性痕量记录和平均值。使用100 μM的Gly和1 μM的Stry。每组N = 11-13个细胞。接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD::GlyR [1S296A]小鼠在新目标区花费的时间百分比(d)和行进的距离(e)。每组6-7只。f接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD::GlyR / 1S296A小鼠在BM试验中训练期和探针试验的逃避潜伏期平均值。每组6-7只。g MWM试验中接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD:GlyR / 1S296A小鼠训练期和探针试验的逃避潜伏期平均值。每组6-7只。h接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD:GlyR / 1S296A小鼠DG中Aβ斑块的代表性图像和定量。标尺，100 μm。每组N = 7只。i接受慢性Veh或CBD治疗的5× FAD:GlyR [1S296A]小鼠DG中斑状Aβ斑块的代表性图像和定量。标尺，50 μm。
图5 慢性给药CBD对5× FAD小鼠DG神经元兴奋性的影响。a 5× FAD小鼠DG颗粒细胞AP记录示意图。慢性Veh或CBD治疗5× FAD小鼠DG切片中颗粒细胞AP流变酶(c)、RMP (d)、尖峰数(e)的痕量记录(b)和平均值。N =每组10个细胞。f 5× FAD:GlyR / 1flox/flox小鼠DG颗粒细胞中AP的记录示意图。慢性Veh或CBD治疗5× FAD:GlyR / 1flox/flox小鼠DG切片中颗粒细胞AP流变酶(h)、RMP (i)、尖峰数(j)的微量记录(g)和平均值。N =每组10个细胞。k 5× FAD:GlyR [1S296A]小鼠DG颗粒细胞AP记录示意图。慢性Veh或CBD治疗5× FAD:GlyR [1S296A]小鼠DG切片中AP流变酶(m)、RMP (n)、颗粒细胞尖峰数(o)的微量记录(l)和平均值。N =每组10个细胞。
图6 急性CBD输注DG对5× FAD小鼠神经亢进的影响。5× FAD小鼠体内单单位DG神经元活动记录示意图。5x FAD小鼠(b)和5x FAD:GlyR [1S296A]小鼠(f)在DG内注射CBD前后DG神经元自发放电的代表性电压迹线和栅格图。5× FAD小鼠(c)和5× FAD::GlyR [1S296A]小鼠(g)在DG内注射CBD前后DG神经元自发放电变化指数。红色表示下调的神经元，蓝色表示不变或上调的神经元。饼状图显示了下调神经元的百分比。c中n = 90个细胞，g中n = 82个细胞。5× FAD小鼠(d)和5× FAD::GlyR * 1S296A小鼠(h)在DG内注射CBD前后DG神经元的峰值率图值。5x FAD (e)和5x FAD::GlyR [1S296A]小鼠(i)在DG内注射CBD前后DG神经元的峰值率汇总数据。j注射AAV-Syn-GCaMP6f和GRIN晶状体植入对单个DG神经元Ca2+成像的示意图。k上:确认GCamp6f表达的代表性图像。比例尺，300 μm;下:来自原始Ca2+成像视频的示例帧。标尺，100 μm。l在CBD处理前后表达AAV-Syn-GCaMP6f的5x FAD小鼠DG神经元中记录有代表性的Ca2+信号痕迹。表达AAV-Syn-GCaMP6f的5x FAD小鼠在CBD处理前后所有记录的DG神经元的Ca2+信号热图(m)和Ca2+事件频率(n)。N = 189细胞。o在CBD处理前后表达AAV-Syn-GCaMP6f的5× FAD:GlyR [1S296A]小鼠DG神经元中记录有代表性的Ca2+信号迹。表达AAV-Syn-GCaMP6f的5× FAD:GlyR] 1S296A小鼠在CBD处理前后所有记录的DG神经元的Ca2+信号热图(p)和Ca2+事件频率(q)。N = 136个细胞。r 散点图显示表达AAV-Syn-GCaMP6f的5× FAD::GlyR / 1S296A小鼠在CBD处理前后DG神经元中记录的ΔF/F值与Ca2+事件的关系。列中的每个点表示一个测试单元格。
结论
神经元多动已被广泛报道为阿尔茨海默病的共同特征，并已成为一个重要的干预靶点。本研究结果表明，CBD可以通过降低阿尔茨海默病的神经元多动性来改善Aβ病理和认知功能。与这一发现一致的是，大量证据表明，逆转AD易感区域(如海马)的异常神经元亢进可减少Aβ沉积并改善AD的认知。例如，用GNE0723增强突触NMDAR亚基epsilon-1，可以减少网络的超兴奋性，改善AD患者的记忆缺陷[65]。这些研究提供了初步证据，表明降低神经元兴奋性可能是治疗阿尔茨海默病的有效途径。然而，导致阿尔茨海默病神经元过度活跃的准确机制仍然难以捉摸，需要进一步研究。
本研究结果表明，CBD通过增强DG中突触外GlyR的功能来实现其抗ad的功效。大量证据表明，大麻素可以介导GlyR的电生理特性，大麻素通过GlyR的电生理特性实现其镇痛和抗癫痫作用。CBD作为一种非致醉性植物大麻素，在临床上被认为更安全有效。例如，CBD衍生物对Dravet综合征和lenox - gastaut综合征显示出先进的治疗效果，Epidiolex®口服溶液最近已被美国食品和药物管理局批准用于治疗神经高兴奋性疾病。除GlyR外，CBD的近65个分子靶点已被确定，如瞬时受体潜在香草酸通道和血清素受体，这些靶点是否也参与CBD介导的抗ad作用尚不清楚。此外，GlyR本身在AD进展中的特征也不清楚，需要进一步研究。我们的研究结果表明，DG中的GlyRα1可能在AD的发病机制中发挥重要作用。在中枢神经系统(CNS)中，除1亚基外，2/3亚基是另外两个重要的GlyR亚型。与α1亚基不同，α2亚基在胚胎期大量表达，在中枢神经系统的早期发育中起重要作用。α3亚基主要分布于成人脊髓，参与多种慢性疼痛。有研究表明在前额叶皮层等前脑中也表达了2/3亚基。然而，α2/3亚基是否也大量分布于海马体DG区并参与CBD对AD的治疗作用尚不清楚，有待进一步研究。除GlyR外，其他一些受体也可能有助于AD的治疗，因为CBD具有多种脑靶点，如瞬时受体电位香草样蛋白2 (TRPV2)和血清素2A受体(5-HT2AR)。例如，CBD通过激活TRPV2增强小胶质细胞Aβ肽的吞噬和清除。激活5-HT2AR可改善神经可塑性和抗炎作用。虽然这些靶点可能参与了CBD介导的AD治疗，但其功能是否发生改变以及在AD中的潜在机制尚不清楚。
此外，CBD对阿尔茨海默病的治疗具有剂量依赖性。低剂量和高剂量(5mg/kg至50mg/kg)的CBD已被证明可以改善AD患者的认知和Aβ病理。然而，高剂量的CBD，如20mg /kg和50mg/kg，可能会影响许多其他靶标，如5-HTR和TRPV，并造成一些不良影响。因此，在我们的研究中，我们选择了5 mg/kg的CBD剂量，这不仅可以帮助我们评估CBD治疗AD的疗效，还可以避免许多不良影响。GABAergic系统作为大脑中的另一种主要抑制因子，也被认为是治疗AD的潜在靶点。一些gaba能药物，包括曲米丙酸、muscimol、异丙酚和苯二氮卓类药物，已被报道在减轻或逆转AD病理方面显示出先进的疗效。然而，长期使用这些药物会带来镇静、焦虑和成瘾等多种精神不良反应。本研究提供的数据表明GlyR可能是治疗AD的有效靶点。值得注意的是，与gaba能系统相比，GlyR的变构调节剂显示出很少的精神副作用，这表明GlyR是AD的一个有希望的治疗点。
DOI: 10.1038/s41380-024-02789-x
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