摘要
背景：天花粉蛋白 （TK） 是从中药栝楼中提取的糖蛋白，具有抗病毒和抗肿瘤活性。然而，TK 抗肿瘤的具体作用机制目前尚不清楚。
目的：本研究旨在确定 TK 在肺腺癌中的新抗肿瘤靶点并研究其抗肿瘤机制。
方法：本研究利用 Lewis 肺癌小鼠模型来评估 TK 对肿瘤生长的抑制作用。CCK8 测定法计算 IC50毛孢松在 A549 和 H1299 上。体外细胞测定和体内异种移植小鼠研究用于研究 MICU3 过表达和 TK 治疗对肿瘤生长的影响。Fluo-4 染料和 JC-1 染色测定线粒体钙水平和膜电位。应用 H&E 和免疫组化染色评估 TK 对肿瘤和微环境的影响。应用 RNA 测序分析 TK 处理和 MICU3 过表达肿瘤细胞的转录组变化。通过 qPCR 和 Western blotting 检测毛孢子烷对 DNMT3B 表达和 MICU3 甲基化的影响。通过 ChIP-PCR 和荧光素酶测定测量 MICU3 基因的转录活性。
结果：天花粉蛋白能够抑制体内肿瘤生长，导致癌细胞生长抑制和细胞死亡，对正常细胞几乎没有影响。集成电路50A549 和 H1299 细胞中毛孢生红素分别为 62.8 μg/ml 和 39.7 μg/ml。线粒体钙摄取家族复合物 MICU3 被证明与良好的预后相关，并且在天花粉蛋白处理后上调，同时减少肿瘤细胞生长和迁移，并在体外和体内增加细胞死亡。在 MICU3 过表达细胞中观察到线粒体钙水平升高。RNA-seq 数据的通路分析显示，细胞因子和受体通路在 MICU3 过表达细胞中富集。天花粉蛋白降低 DNMT3B 表达并改变 MICU3 甲基化，同时增加 FOSL2 表达并减少与 MICU3 基因转录增加相关的甲基化。
结论：天花粉蛋白通过抑制 DNMT3B 和增加 FOSL2 在肺腺癌中引发抗肿瘤活性，进而诱导 MICU3 介导的线粒体钙内流和肿瘤细胞死亡。
图文简介
图1 TK在体内的抗肿瘤活性。A. 在路易斯肺癌小鼠模型中，腹腔注射TK以评估其对肺癌肿瘤生长的影响；B-C. 每组 5 只小鼠，下图显示肿瘤体积和荧光信号强度；D. 肿瘤组织学 H&E 和免疫组化（IHC）染色显示肿瘤标志物 EpCAM 和 Ki67、免疫标志物 CD45、纤维细胞标志物 α-SMA 和血管内皮细胞标志物 CD31
图2 TK 抑制癌细胞生长并在体内诱导细胞死亡。A. A549 和 H1299 细胞用TK和 IC 处理50使用细胞活力测定法计算 A549 和 H1299 细胞系中TK的值。B. CCK8 测定确定TK处理对 A549、H1299 和 BEAS-2B 细胞系的总体影响;C. 对照组和TK处理组 A549 、 H1299 和 BEAS-2B 的明场形态;D. 用 FACS 分析评估活/死细胞死亡;E. 用 Annexin V-PI 双染测定细胞凋亡率，并用 FACS 分析评估;F.进行 Caspase 3 活性测定以评估TK对 A549 、 H1299 和 BEAS-2B 细胞的影响;G. 进行 Western blotting 检测 A549 和 H1299 细胞系上TK的凋亡标志物;H. 用 JC-1 探针检测线粒体膜电位。
图3 MICU3 抑制肿瘤生长和侵袭。A. 进行 MICU3 Western blotting 检测TK处理对 A549 和 H1299 细胞系的影响;B. BEAS-2B、A549 和 H1299 细胞中 MICU3 的 qRT-PCR（上图）和蛋白质印迹（下图）检测;C. 在对照组和 oeMICU3 组中检测 MICU3 的 mRNA （上图） 和蛋白质 （下图） 表达;D. CCK8 测定检测 MICU3 过表达对细胞生长的影响;E. Annexin V-PI 双染色测定检测 MICU3 过表达对细胞凋亡的影响;F. 检测 MICU3 过表达对细胞迁移影响的伤口愈合试验;G. 异种移植小鼠模型评估 MICU3 过表达对肿瘤生长的影响。
图4 MICU3 诱导线粒体钙，与细胞因子受体信号传导有关。一个。在 MICU3 过表达、对照和TK处理的 A549 细胞中用 Fluo-4 染料染色检测钙信号;B. 火山图显示 oeMICU3 组中差异表达的基因;C. 差异基因的显着顶部富集的 KEGG 通路;D. oeMICU3 组中差异基因的功能网络。
图5 MICU3 在肺癌中受 DNA 甲基化和 DNMT3B 的调节。一个。肺癌中 MICU3 的 DNA 甲基化显著高于正常样本;B. DNA 甲基化和 MICU3 的 mRNA 水平显着负相关;C. TK抑制 A549 和 H1299 细胞中 DNNMT3B 的表达;D. DNNMT3B 和 MICU3 mRNA 呈显著负相关;E. DNNMT3B 敲低显著降低整体甲基化水平;F.基因体区域的差异甲基化区 （DMR） 分布热图;G.MICU3 基因体区域中的差异甲基化区（DMR）。
图6 MICU3 在肺癌中被 FOSL2 转录激活。A. ChIP-Atlas 富集分析确定了 MICU3 的前 20 转录因子;B. 显著富集的转录因子与 TKrGs 进行比较，生成了 12 个共同基因;C. TK处理组和对照组中 12 种转录因子的表达热图;D. MICU3 启动子区域上 MAFK 和 FOSL2 的 ChIP 测序峰;E。MAFK 和 FOSL2 基因体区域中的差异甲基化区 （DMR）;用 qRT-PCR 检测 FOSL2 和 MICU3 在 FOSL2 敲低癌细胞中的表达;G. ChIP-PCR 检测 FOSL2 结合 MICU3 启动子区，在对照和TK处理的癌细胞中;H. 荧光素酶报告基因检测TK对 FOSL2 转录活性的影响。
结论
本研究探究了天花粉蛋白的作用机制，并确定 MICU3 是一种新的有利预后标志物和肿瘤抑制因子。TK通过抑制 DNMT3B 和诱导 FOSL2，触发 MICU3 介导的线粒体钙内流和肿瘤细胞死亡，在肺腺癌中表现出抗肿瘤活性。这些发现有助于进一步了解TK，并促进其在癌症治疗中的潜在治疗应用。
DOI: 10.1016/j.jare.2024.11.001
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