摘要
对当前雄激素受体信号抑制剂（ARSI）疗法的耐药性导致治疗诱发的神经内分泌样前列腺癌（t-NEPC）的发病率更高。这种高度侵袭性的亚型具有主要的小细胞样特征，对紫杉醇化疗有抵抗力，并且总体生存率很低。t-NEPCs大多采用铂类药物联合依托泊苷或紫杉醇进行治疗，选择性较低且全身毒性较高，这往往限制了其临床潜力。在 t-NEPC 转化过程中，腺癌失去其管腔特征并采用神经基底特征。t-NEPC 的适应性神经元特征是否导致这种紫杉醇耐药性仍不清楚。患者基因表达数据库的通路分析表明，t-NEPC 上调与增强的细胞网络相关的各种神经元通路。为了鉴定对促进 t-NEPC 神经元特征基因表达可能重要的转录因子 (TF)，我们在 NE 样细胞中进行了 ATAC-Seq、乙酰化组蛋白 ChIP-seq 和 RNA-seq线模型并分析了转录活性和显着富集的神经内分泌样（NE样）癌症特异性基因的启动子。我们的结果表明 Pax5 可能是神经元基因表达的重要转录因子，并且对 t-NEPC 具有特异性。通路分析显示 Pax5 表达参与轴突引导、神经递质调节和神经元粘附，这对于强大的细胞通讯至关重要。进一步的结果表明，Pax5 的耗竭会破坏 NE 样细胞中神经突介导的细胞通讯，并减少表面生长因子受体的激活，从而使它们对多西紫杉醇疗法敏感。此外，Pax5启动子CpG岛的t-NEPC特异性羟甲基化有利于Pbx1结合以诱导Pax5表达。根据我们的研究，我们得出结论，持续暴露于 ARSI 疗法会导致 t-NEPC 中的表观遗传修饰和 Pax5 激活，从而促进采用紫杉醇抗性 NE 样癌症所需的基因表达。因此，靶向 Pax5 轴可能有利于恢复其紫杉醇敏感性。
图文简介
图1 神经内分泌分化带有神经元特征。C4-2BER和C4-2B细胞rna表达的差异红色表示满足p值临界值<0.05且fold change≥2的基因。B腺细胞(C4-2B和C4-2三倍体)和ne样细胞(C4-2BER和DKD三倍体)基因表达比较研究。I型基因集代表REST抑制因子调控的基因，II型基因集代表参与神经内分泌通路的转录调控因子。通过RNA-seq分析了所有细胞系中RNA的表达。C类似腺和神经内分泌细胞系中AR调控基因的比较分析。维恩图表示两种不同的神经内分泌样细胞系中共同的差异表达基因。E使用共同差异富集基因集，用gProfiler进行通路分析。BP生物途径，MF分子途径。散点图表示与神经内分泌转化相关的不同富集通路。
图2 神经内分泌分化中染色质可及性的差异。热图显示C4-2B和C4-2BER中不同上调基因的ATAC-Seq信号(BPM归一化)比较。B热图显示C4-2B和C4-2BER中差异下调基因的ATAC-Seq信号(BPM归一化)比较。C IGV浏览器显示C4-2B和C4-2BER中Hox A基因位点的ATAC序列信号(BPM)差异。D免疫印迹显示C4-2B和C4-2BER中H3K9、H3K18和H3K27的组蛋白乙酰化水平。条带的量化用条形图表示。E热图显示了H3K27ac和H3K18ac在C4-2B和C4-2BER中不同活性位点的ChIPSeq信号(BPM标准化)的比较。维恩图显示了发生在4- 2ber ATAC-seq峰上的差异ChIP-Seq (H3K18ac和H3K27ac)峰的重叠。图2F中差异活性染色质位点附近基因的G RNA-seq表达水平(TPM)。
图3 新可达启动子附近的差异转录因子结合。A. C4-2B和C4-2BER细胞(N= 3)， B . C4-2和DKD细胞(N= 3)， C, D . RT-PCR分别显示C4-2与DKD和C4-2B与C4-2BER细胞中Pax5、ETV5、FOXC1、ETS2、KLF12、ELF3基因的相对表达。E图显示了与TOMTOM测定的Pax5基序在活性位点上的差异。
图4 Pax5在不同细胞类型中的表达。免疫印迹法比较Pax5在C4-2、C4-2B、C4-2BER、DKD和NCI-H660中的表达。HSC70是加载控制器。免疫印迹是N= 3个独立实验的代表。B型RT-PCR显示C4-2B和C4-2BAR细胞中Pax5的RNA表达。从转基因动物PB-Cre:High-Myc/Pten KO/Trp53R172H衍生的小鼠细胞系中缺失RB1后C Pax5的表达。LuCaP TMA染色D Pax5。具有代表性的免疫组化染色显示Pax5在腺癌、CRPC和ne样癌中的表达。黑色高亮区域为×40中Pax5核染色。条形图表示Pax5正、负情况。条形图上方的数字表示总的病例数中Pax5阳性病例数。E Pax5在转移性前列腺TMA中染色。IHC中具有代表性的Pax5表达如图所示。柱状图表示Pax5阳性和阴性情况的数量。条形图上方的数字表示总的病例数中Pax5阳性病例数。
图5 Pax5在ne样细胞中调控多种神经元相关通路。Pax5缺失后C4-2BER和DKD重要神经元通路中Pax5调控基因表达谱的热图。使用Pax5缺失后ne样细胞中差异调节的Pax5基因进行GSEA通路分析。C、D: siRNA瞬时缺失Pax5后，ne样细胞(C4-2BER和DKD)中Pax5调控基因集的验证。E, F强力霉素诱导的两种独立shrna短暂耗尽Pax5后，neelikes细胞(DKD)中Pax5调控基因集的验证。G ChIP-qPCR显示pax5调控基因比阴性对照PGM5(使用两个引物组P1和P2)和IgG富集。
图6 Pax5的缺失影响细胞通讯，提高治疗效果。A-E免疫荧光检测在siRNA或shRNA(强力霉素可诱导，其中shRNA的表达由红色荧光指示)或Pax5敲除细胞中Pax5的异位表达后，DKD和C4-2BER细胞中NCAM1的表面表达。对于C4-2BER，对照组转染shPax5，但不添加强力霉素。箭头表示靠近其他细胞的NCAM1阳性神经突样突起。(白色箭头显示靠近邻近细胞的NCAM1阳性神经突样结构，而黄色箭头显示NCAM1阳性神经突的缺失)。图中为a的总细胞场。采用蔡司Zen blue软件进行三维重建。A, D为三维重构图像。超级图分别代表了A和D的NCAM1表面定位的量化。C免疫印迹显示Pax5和NCAM1在缺失状态下的表达以及Pax5在DKD中的异位表达。DAPI代表细胞核。比例尺为100像素。F超级图分别表示Pax5缺失和Pax5过表达情况下C4-2BER和DKD神经突数量的定量。**经Student 's t检验计算P < 0.001。细胞体上有橙色圆圈标记。从橙色圆圈中，任何接触或穿过白色圆圈的突起都被认为是神经突样结构，如图所示。G免疫印迹显示NCAM1在对照生物素化下拉样品和DKD中pax5缺失的情况下表达。总蛋白也在控制和Pax5缺失下。H-K在Pax5存在和不存在的情况下，分别用碘化丙啶染色测定DKD和C42BER细胞在化疗应激下的H-K细胞活力。H、J图为细胞死亡分析图。在Pax5敲低的条件下，通过异位表达Pax5进行恢复实验。赫斯特(蓝色)为核染色。多西紫杉醇分别以5 nM和10 nM的浓度加入C4-2BER和DKD(根据其IC50值)。图1和图K分别表示Pax5在DKD和C4-2BER中的下调和过表达。L, M免疫荧光图像显示在DKD和C4-2BER细胞中Pax5存在和不存在时，phospho-AKT S-473表面染色(DKD为品红色，C4-2BER为绿色);显示量化的条形图。DAPI为细胞核染色。N控制和Pax5敲除条件下DKD中磷酸化AKT 473和总AKT的免疫印迹。通过分析Pax5的表达来检测敲除效率。Hsc70表示加载控制。O免疫印迹表示DKD控制和Pax5敲低条件下磷酸化EGFR与总EGFR的表达。Hsc70表示加载控制。
图7 Pbx1调控Pax5。C4-2B和C4-2BER细胞Pax5启动子附近的ATAC-seq和H3K18/H3K27乙酰化ChIP-seq信号。B Pbx1在DKD vs C4-2和C4-2BER vs C4-2B中的表达。C免疫印迹法检测Pbx1在腺细胞和ne样细胞中的表达。HSC70表示加载控制。免疫印迹是N= 3个独立实验的代表。D, E RT-PCR分别表示DKD和C4-2BER细胞中Pbx1缺失后Pax5的表达。经Student 's t检验，**P < 0.001， *P < 0.01。误差条表示N= 3个生物重复之间的标准误差。F免疫印迹检测C4-2BER细胞中Pbx1缺失后Pax5的表达。HSC70是加载控制。利用Pax5 TSS上游设计的引物进行gpbx1 ChIP-qPCR。-ve符号表示Pax5启动子TSS下游。数字表示Pax5引物发育的位置。比较了Pax5启动子上Pbx1在腺和NE-like状态下的结合情况。在输入归一化后，计算相对于IgG对照的Pbx1结合的富集程度。经Student 's t检验，**P < 0.001， *P < 0.01。误差条表示N= 3个生物重复之间的标准差。H DKD和C4-2细胞Pax5基因的Epic甲基化阵列分析示意图。绿色三角形代表CpG岛下面的区域。两个细胞系近端启动子的胞嘧啶甲基化状态被放大，序列显示每个区域的甲基化状态。红色代表甲基化/修饰的胞嘧啶，而绿色代表去甲基化的胞嘧啶。启动子处Pbx1结合视线用箭头表示。免疫印迹检测TET2在不同前列腺癌细胞系中的表达。HSP70作为加载控制。采用ChIP-qPCR分析Pax5启动子区Pbx1结合位点的j5hmc足迹标记。在输入归一化后，计算5 hmC足迹的Fold富集以及Pbx1结合相对于IgG控制。用Bobcat339 (50 μM)处理DKD细胞18-24 h后，进行K 5hmC和Pbx1 ChIP-qPCR检测，并与对照对照进行比较。引物1 (Pax5的Pbx1结合位点)用于扩增chip富集区域。经学生t检验，*P < 0.01， **P < 0.001。误差条表示N= 3个生物重复之间的标准差。在输入归一化后，计算5hmC足迹的Fold富集以及Pbx1结合相对于IgG控制。采用L - RT-PCR检测5-氮杂胞苷(0.1 μ m)和Bobcat339处理DKD细胞5 ~ 7 d后Pax5基因的表达情况。M表示t-NEPC维持过程中Pbx1/Pax5整体调控的示意图。
讨论
使用新一代抗ar疗法可能提高CRPC病例的总生存率;然而，抗性克隆具有很强的侵袭性，并以各种克隆形式存在。在这些耐药人群中，与腺癌亚型相比，近20%的人表现出ne样转化，具有独特的遗传特征。ne样癌症是高度致命的，并且经常导致癌症的过度扩散，这很难控制。尽管在病理学上，这些癌症是高度异质性的，但它们确实遵循一些共同的遗传特征。此外，虽然治疗诱导的反式分化的起源仍在研究中，但最近的报告表明，这些癌症的遗传特征与新生神经内分泌癌(包括小细胞肺癌)保持着明显的相似性。这表明一个共同的机制强调了ne样PCa的临床表现。在这项研究中，通过比较腺癌和ne样癌之间的染色质可及性、表观遗传特征和基因表达，我们发现Pax5在ne样转化过程中是一个重要的转录因子。
在分析与ne样反分化过程相关的基因表达性质时，本研究结果表明，与神经元分化、轴突发生、神经元通讯相关的通路在ne样癌症中选择性富集，如其他文献报道的那样。本研究结果表明，ne样癌症中神经元基因表达的增加与转录活性染色质标记的增加有关，包括可及性和组蛋白修饰。虽然我们关注的是启动子的染色质活性状态，但很可能增强子区域染色质状态的改变也有助于t-NEPC的转化，未来使用Hi-C和HiChIP来理解增强子-启动子相互作用的工作可能会揭示t-NEPC转化的新见解。目前，我们的研究结果表明，许多差异基因改变了Pax5结合位点的启动子染色质状态。Pax5表达已在各种ne队列中得到验证，包括PDX模型。对转移性TMA的进一步研究表明，部分神经内分泌患者Pax5表达阴性;表明Pax5的表达与ne样反分化相关，可能是阶段特异性的，也可能是克隆特异性的。与CRPC类似，Pax5在神经内分泌肺癌和n型神经母细胞瘤细胞中也有表达，并被报道与癌症的侵袭性有关。有趣的是，在神经内分泌肺癌中，Pax5的异质性表达在小细胞(SCLC)亚型中最高，其次是大细胞和类癌。由于SCLC和ne样PCa的遗传相似性，本研究结果表明患者样本中存在相似的异质性，因此值得在更大的队列中进行更深入的研究。Pax5在腺癌组织中的缺失表明Pax5的表达可能是ne亚型的特异性转录事件。然而，来自转移性TMA的IHC显示LuCaP173.2A的一个核心，代表双阴性前列腺癌(DNPC;AR阴性，不表达经典NE标志物(如CHGA和SYP，但表达EZH2和MYCN)，也表达低水平的Pax5。报告显示，这个带有串行通道的LuCaP173.2开始表达像SYP这样的NE标记;因此，说明这种ne -分化可能是双阴性PCa的疾病连续体。因此，本研究需要在更大的双阴性患者组织队列中进一步研究，以证明Pax5在分化过程中的表达。最近，Pax5的关联被预测在不依赖ar的CRPC生长中。此外，另一组Pax分子，被称为Pax6，已被证明具有前列腺ne样转化。总的来说，研究表明pax组转录调节因子在ne样癌症发展中的重要性。
在研究ne样癌中Pax5表达的潜在机制时，发现Pbx1参与了Pax5的转录。研究结果表明，Pbx1在ne样癌症中选择性过表达，这在患者的基因表达数据中得到了进一步的验证。在异种移植的神经内分泌前列腺癌中也观察到Pbx1的表达。尽管存在这些联系，但尚未研究Pbx1在t-NEPC中的功能重要性。Pbx1有两个同工异构体。虽然在腺癌中观察到Pbx1的表达，但Pbx1的异构体特异性表达是否在t-NEPC中起作用还有待进一步研究。研究结果揭示了Pbx1在ne样PCa中的重要作用。ATAC-seq数据显示，Pax5启动子内Pbx1结合位点的ne特异性染色质可及性，以及CpG岛胞嘧啶的羟甲基化。研究表明，高5hmc是ergg阴性前列腺癌生化复发的不良预测因子，并可作为前列腺癌发展的预后指标。本研究强调了在ne样转化中检测5hmC相对于基因表达的重要性。虽然在Pax5启动子上证明了5hmC，但未来使用全基因组方法测量5hmC的研究将揭示基因激活、染色质可及性、组蛋白修饰和特定ne样反分化亚型中启动子5hmC特征之间的重叠。
本研究结果表明，Pax5参与了ne样癌症中特定神经元基因特征的转录。由于神经元轴是前列腺癌生长和存活的主要轴之一(仅次于AR轴)，抑制该轴可使癌细胞对治疗敏感。这对于ne样癌症尤其重要，因为它的存活高度依赖于神经元轴。在这些方面，Pax5作为PCa神经元轴的重要调节因子的鉴定具有重要意义。Pax5的缺失不仅可以减少神经突样突起，还可以诱导细胞对多西他赛治疗产生反应。神经突投射的减少可以破坏ne样细胞的跨细胞通讯，从而使它们对治疗性应激变得敏感。在这种情况下，本研究数据表明，pax5介导的NCAM1在细胞表面的稳定对其多西紫衫醇抗性具有重要意义。尽管NCAM1的表达与SYP和CHGA一起是神经内分泌转化的预测标志物，但NCAM1可能不仅仅是t-NEPC的标志物，NCAM1的定位对于研究t-NEPC的治疗耐药可能很重要。尽管如此，Pax5缺失如何改变NCAM1的表面定位还需要深入研究。针对ne样PCa具有挑战性;因此，确定Pbx1/ pax5调控的功能有助于未来治疗策略的制定。
总之，本研究结果说明了PBX1/ Pax5转录轴在维持ne转分化过程中的功能重要性。这对于了解疾病的病因以及筛查或检测神经内分泌转化具有重要意义。了解这种异质性具有广泛的意义，特别是在制定选择性治疗策略方面。总之，本研究为ne样前列腺癌的筛查提供了新的途径。
DOI: 10.1038/s41419-024-06916-y
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