Advanced Science|双氢青蒿素调节肠道胶质细胞异质性以减轻结肠炎

图2 发炎结肠组织中 GFAP/S100β EGC 的丰度增加。A） EGC 参与肠道血管屏障 （GVB） 的形成，并与肠上皮屏障 （IEB） 密切相关。对照和慢性 DSS 诱导的结肠炎小鼠粘膜下丛中 GFAP（红色）和 S100β（绿色）的代表性全安装染色 B） 和定量 C-E）。DAPI（蓝色）对细胞核进行染色。在对照和 DSS 诱导的结肠炎小鼠的结肠粘膜和固有层中测定 GFAP EGCs F，G） S100β EGCs、H、I） 和 GFAP/S100β EGCs、J、K） 的百分比。L） 健康个体和 UC 患者全层结肠切片中用 GFAP（红色）和 S100β（绿色）标记的 EGC 的代表性免疫荧光图像。DAPI（蓝色）对细胞核进行染色。定量健康个体和 UC 患者结肠组织中 GFAP 细胞 M）、S100β 细胞 N） 和 GFAP/S100β 细胞 O）。P） 健康个体（绿点）和 UC 患者（红点）中 hEGC 聚类 6 的无监督子聚类。Q） 每个亚群中表达 GFAP 或 S100β 的 EGC 的比例。具有大于 3 和非零值的单个细胞分别定义为 GFAP 和 S100β（n = 5 个 Drop-seq 重复）。EGC 簇的无监督分析表明，EGC 亚群基因特征分别与 EGC#1、EGC#2 和 EGC#0 中的 S100β R）、GFAP S） 和 S100β+GFAP T） 富集相关。U） 健康和发炎条件下肠道粘膜和粘膜下微环境的示意图：在健康状态下，GFAP EGCs 占主导地位，而在发炎状态下，GFAP/S100β EGCs 增加。每个样品中大约有 50 个细胞被调查，并使用 5 个视野进行定量。DSS，葡聚糖硫酸钠;EGC，肠胶质细胞;DAPI，4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚;UC，溃疡性结肠炎。比例尺如图所示。n = 5 对于每组。数据是 SEM ±平均值。**p <0.01，***p <0.001。

图4 EGC 异质性的 DHA 调节。A） 代表性的整体染色和定量 B-D） GFAP（红色）和 S100β（绿色）在不同组小鼠的粘膜下丛中。DAPI（蓝色）对细胞核进行染色。不同组小鼠粘膜下丛中 GFAP EGC （B） 、S100β EGC （C） 和 GFAP/S100β EGC （D） 的定量。E） 用于流式细胞术分析的小鼠结肠原代 EGC 提取示意图。检测 GFAP EGCs、F） 和 GFAP/S100β、EGCs、G） 在接受或不使用 DHA 治疗的结肠炎小鼠和相应对照小鼠的结肠粘膜和固有层中的百分比。H-I） 在有或没有 DHA 治疗的炎症条件下 EGCs 表面标志物（GFAP 和 S100β）表达的蛋白质印迹分析。通过 ELISA 测定每组 EGC 中 GDNF J）、IL-1β K） 和 CXCL10 L） 的细胞内水平。M） ELISA 测定每组 EGC 中的细胞外 IL-1β 水平。N） DHA 在炎症条件下调节 EGC 异质性的图形摘要：DHA 抑制 GFAP EGC 转化为 GFAP/S100β EGC，并在炎症背景下促进 GFAP/S100β EGCs 转化为 GFAP EGC。DHA，双氢青蒿素;DSS，葡聚糖硫酸钠;LMMP、纵肌层和纵肌/肌间神经丛;EGC，肠胶质细胞;DAPI，4'，6'-二脒基-2-苯基吲哚。比例尺如图所示。n = 5 对于每个组（A、F 和 G）。数据是 SEM ±平均值。**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

图5 在炎症情况下，DHA 导致 GFAP/S100β EGC 进入细胞周期停滞并发生细胞凋亡。A） DHA 处理后发炎 EGC 中活性转录基因的火山图，其中显著差异表达基因 （DEG） （P 值< 0.05，> ± 的两倍）标记为红色（上调）和蓝色（下调）。B） DHA 处理后发炎 EGCs 中 DEGs 的 KEGG 通路富集分析。C） 用于 KEGG 富集分析的部分 DEGs 热图。D） 有或没有 DHA 处理的炎症 EGC 的细胞周期分析。E） 细胞周期的定量分析。F） 有或没有 DHA 处理的炎性 EGC 的细胞凋亡分析。G） 细胞凋亡的定量分析。H-I） 在炎症条件下用或不用 DHA 处理的 EGC 中凋亡蛋白（裂解的 Caspase-3、Bcl-2 和 Bax）表达的蛋白质印迹分析。J） 在用或不用 DHA 治疗的结肠炎小鼠和相应对照小鼠的全层结肠切片中，用 GFAP（品红色）和 S100β（绿色）染色的 EGC 上裂解的 Caspase-3（红色）表达的代表性免疫荧光图像。DAPI（蓝色）染色的细胞核。定量每组结肠组织中 GFAP/裂解的 Caspase-3 细胞 （K）、S100β/裂解的 Caspase-3 细胞 L） 和 GFAP/S100β/裂解的 Caspase-3 细胞 M）。每个样品中大约有 50 个细胞被调查，并使用 5 个视野进行定量。DHA，双氢青蒿素;DSS，葡聚糖硫酸钠;EGC，肠胶质细胞;DAPI，4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚;KEGG，京都基因和基因组百科全书。比例尺如图所示。n = 5 对于每个组 J）。数据是 SEM ±平均值。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

图6 用或不用 DHA 治疗的结肠炎小鼠和相应的对照小鼠肠道微生物群的 16S 核糖体 RNA （rRNA） 测序分析。A） 各组的 Chao1 指数显示微生物群落的α多样性。群落直方图显示了 B）、C） 类和 D） 级水平的微生物组成谱。每行代表每只鼠标，n = 3 代表每组。热图显示了 E） 科 F） 属和种 G） 水平的微生物组成谱的相对丰度。每列代表每只鼠标，每组代表 n = 3。H） 主要坐标分析揭示了肠道微生物组的多样性。每个点代表每只老鼠，每组 n = 3。使用相似性分析 （ANOSIM） 评估聚类的显着性。I） 线性判别分析 （LDA） 确定各种分组中最丰富的属。显示了满足 LDA 显著阈值 3.6 的分类群。J） 分支图揭示了丰富度的差异，以及丰度最高的组。每个点的亮度与其效果呈正相关。KL） 与 LPS 预孵育后（有或没有 DHA 处理）EGC 的 GFAP、S100β 和细菌产物相关信号分子 （c-Fos、TLR4、NF-κB 和 iNOS） 表达的蛋白质印迹分析。DHA，双氢青蒿素;DSS，葡聚糖硫酸钠;EGC，肠胶质细胞;LPS，脂多糖。数据是 SEM ±平均值。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

图7 图形摘要：DHA 通过促进微生物群稳态对结肠炎发挥保护作用来调节 EGC 表型变化。在慢性结肠炎中，微生物产物或代谢物以及炎症刺激可导致肠上皮屏障 （IEB）和肠道血管屏障（GVB） 同时受损，并伴有发炎肠道微环境中 GFAP/S100β 肠胶质细胞 （EGC） 的增加。双氢青蒿素 （DHA） 治疗主要通过多种机制有效缓解结肠炎并促进肠道屏障功能的恢复：DHA 诱导 GFAP/S100β EGCs 向 GFAP EGCs 的表型转化或诱导 GFAP/S100β EGCs 凋亡，同时抑制 GFAP EGCs 向 GFAP/S100β EGCs 的转化。DHA 对 EGC 异质性的调节作用是通过微生物产物或代谢物/TLR4/NF-κB/iNOS 信号轴介导的，并伴有 c-Fos 的激活。EGC，肠胶质细胞;DHA，双氢青蒿素;LPS，脂多糖;GDNF，神经胶质细胞衍生的神经营养因子。