Advanced Science|人参皂苷 Rg3 通过 GRB2 恢复线粒体心磷脂稳态预防帕金森病

调节心磷脂以维持线粒体稳态是治疗帕金森病(PD)的一种有前途的策略。通过涉及多个模型的综合筛选和验证过程，人参皂苷Rg3 (Rg3)被确定为能够提高心磷脂水平的化合物。心磷脂水平的增加通过增强线粒体未折叠蛋白反应、促进线粒体自噬和增强线粒体氧化磷酸化来促进线粒体稳态。因此，这种级联增强了酪氨酸羟化酶阳性(TH+)多巴胺能神经元的存活，导致PD小鼠模型中运动性能的改善。利用有限蛋白水解-小分子定位结合分子对接分析，证实了生长因子受体结合蛋白2 (GRB2)是Rg3的分子靶点。此外，这些研究表明Rg3促进GRB2与TRKA (Neurotrophic Tyrosine Kinase Receptor, Type 1)的相互作用，从而促进ERK磷酸化EVI1 (Ecotropic Virus Integration Site 1 Protein Homolog)，进而增加CRLS1 (Cardiolipin Synthase 1)基因表达，促进心磷脂合成。grb2或CRLS1的缺失显著减弱了rg3对PD症状的有益作用。最后，进一步鉴定了Tenofovir Disoproxil Fumarate (TDF)，它也能促进GRB2和TRKA之间的结合。所鉴定的化合物Rg3和TDF通过增强心磷脂表达和恢复线粒体稳态，显示出预防pd的良好潜力。

图1 PD模型的线粒体CL缺失和线粒体功能障碍。a) aav5 - vector -和AAV5-A53T𝛼Syn-injected小鼠SN中的线粒体CL水平，盐水处理和mptp处理小鼠SN中的线粒体CL水平(20 mg kg - 1, i.p)(每组n = 10只)。用pCMV3-Vector或pCMV3-A53T-𝛼Syn-His转染SH-SY5Y细胞48 h(b、d、e、h和i)，用mpp+ (600 μM)或6-OHDA (60 μM)处理SH-SY5Y细胞24h(b、d、e、handi)。b) SH-SY5Y细胞线粒体CL水平。每种条件下进行3个独立实验。c) UC017和SPD501 DA神经元线粒体CL水平。每种条件下进行5个独立实验。d,e)通过TMRM染色评估SH-SY5Y细胞线粒体膜电位。tmrm的平均荧光强度定量图。每个条件分别进行3个独立实验(比例尺= 50 μm)。f,g)通过TMRM染色评估UC017和SPD501 DA神经元线粒体膜电位。TMRM的平均荧光强度定量图。每个条件分别进行3个独立实验(比例尺= 20 μm)。代表性图像来自三个独立的实验(d和f)。h,i) SH-SY5Y细胞线粒体细胞色素c氧化酶活性测定(h)和细胞内ATP浓度测定(i)。每种条件下进行3个独立实验。j,k) UC017和SPD501 DA神经元线粒体细胞色素c氧化酶活性(j)和胞内ATP浓度(k)的测定。每种条件下进行3个独立实验。l) UC017和SPD501 DA神经元中线粒体自噬、mitoUPR和Oxphos相关基因的mRNA表达。每个条件下三个独立实验。数据归一化到未处理组(e)或UC017组(g,l)。给出了平均值的平均值±标准误差。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。学生双尾非配对t检验(a-c, e, g-l)。

图2 通过GRB2上调CL对神经保护的作用。a)火山图显示了通过无标记质谱法定量的具有结合Rg3潜力的蛋白质。只有在两次或三次重复中鉴定出的蛋白，其倍数变化>5.5且p值< 0.02，才被认为是rg3结合蛋白。b) SH-SY5Y细胞转染指定sirna和pCMV3Vector或pCMV3-A53T-𝛼Syn-His 24小时后，用Rg3 (5 μM)或DMSO(0.1%)处理24小时。采用CCK-8法评估细胞毒性，每种条件有5个独立实验。c)转染Scramble或GRB2 sirna 24 h后，SH-SY5Y细胞用Rg3 (5 μM)或DMSO(0.1%)处理24 h。测定线粒体CL水平，每种条件分别进行3次独立实验。d - f)在Rg3 (5 μM)或DMSO(0.1%)处理的SH-SY5Y细胞中，将可溶性蛋白部分加热变性24小时。可溶性蛋白部分中GRB2和GAPDH的western blotting代表性图像显示为d)。GRB2水平(e)和GAPDH水平(f)的定量。g)通过a测定Rg3与GRB2的结合亲和力ForteBio Octet系统。h) GRB2潜在交联位点。虚线表示氨基酸残基与Rg3之间的距离。Leu-120、Arg-67和Arg-86是通过氢键与Rg3交联的位点。数据归一化到Vector_DMSO组(b)。给出平均值的平均值±标准误差。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001, ns，无统计学意义。单因素方差分析采用Tukey多重比较检验(b)，双因素方差分析采用Sidak多重比较检验(c、e、f)。源数据见Source data文件

图3 Rg3增强了GRB2和TRKA在人神经细胞中的相互作用。a - c)用Rg3 (5 μM)或DMSO(0.1%)处理SH-SY5Y细胞24小时。用抗grb2抗体免疫沉淀细胞裂解液a)进行Western blotting，评估TRKA和EGFR的表达。定量TRKA水平b)和EGFR水平(c)。d)随后用Rg3 (5 μM)或DMSO(0.1%)处理SH-SY5Y细胞24小时用Scramble或TRKA sirna转染24小时。SH-SY5Y细胞线粒体CL的定量。每个条件在(a-d)内进行3个独立实验。e) GRB2与TRKA的结合构象如图所示。GRB2和TRKA与Rg3结合后的结合构象如图所示。f - h) SH-SY5Y细胞分别用Rg3 (5 μM)、GW441756 (10 μM)或DMSO(0.1%)处理6小时。通过Native PAGE和免疫印迹法分析含有GRB2和TRKA的高分子质量物种，以GAPDH作为上样(f)。细胞裂解物中的TRKA和GAPDH (g)。p-TRKA水平的定量(h)。f-h中每个条件进行三个独立实验。i - k)野生型或突变型GRB2与Rg3预孵育30分钟。TRKA与GRB2 (i)、TRKA与GRB2-Rg3 (j)以及TRKA与GRB2突变体-Rg3 (k)之间的结合亲和力采用ForteBio Octet系统测定。每个条件在(i-k)中进行三个独立实验。数据归一化到DMSO组(b, c和h)。给出平均值的平均值±标准误差。*p < 0.05， **p < 0.01， **p < 0.001, ns，无统计学意义。学生双尾非配对t检验(b, c)， Sidak多重比较检验的双向方差分析(d)， Tukey多重比较检验的单向方差分析(h)。

图4 Rg3诱导人神经细胞中crls1表达上调。a) Rg3 (10 μM)或DMSO作用NL5901菌株12 d后的YFP信号。定量的yfp荧光强度显示。每种条件下进行4个独立实验。b)用含有指定sirna的细菌在培养板上培养三代的N2菌株。NAO染色评价N2株的CL水平。NAO平均荧光强度定量图。c) Rg3 (10 μM)、CL (100 μgmL−1)或DMSO处理NL5901菌株12 d后的YFP信号。定量的YFP荧光强度显示。(b)和(c)每种情况下分别进行3个独立实验。d) CRLS1在人SN和壳核中全基因组差异表达分析的统计分析。e - h)用pCMV3-Vector或pCMV3-A53T-𝛼Syn-His转染SH-SY5Y细胞48小时(e)或mpp+ (600 μM)或6-OHDA (60 μM)处理24小时(e)，以及UC017和SPD501 DA神经元(g)中CRLS1水平的定量(f,h)。(e-h)中每个条件分别进行3个独立实验。i) SH-SY5Y细胞在转染scramble siRNA或CRLS1 siRNA, pCMV3-Vector或pCMV3-A53T-𝛼Syn-His 24小时后，分别用Rg3 (5 μM)或DMSO(0.1%)处理24小时。采用CCK-8法评估细胞毒性，每种条件下进行5个独立实验。j,k) Rg3 (5 μM)或DMSO(0.1%)转染Scramble、GRB2或TRKA sirna 24小时后，SH-SY5Y细胞中CRLS1、GRB2、TRKA的代表性western blot图像。定量CRLS1水平(k)。l-o) pCMV3-A53T-𝛼Syn-His;用DMSO(0.1%)、Rg3 (5 μM)或CL (10 μM)处理scramble siRNA或CRLS1 siRNA 24 h。NAO平均荧光强度定量图(l)。TMRM平均荧光强度定量图(m)。SH-SY5Y细胞CL的NAO染色(比例尺= 100 μm) (n)。TMRM染色评估SH-SY5Y细胞线粒体膜电位(比例尺= 50 μm) (o)。每个条件分别进行3个独立实验在(j-o)中执行。代表性图像来自三个独立的实验(n, o)，数据归一化为Scramble组(b, c)， DMSO组(f)， UC017组(h)或Scramble_DMSO组(i, k, l和m)，给出平均值的平均值±标准误差。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001, ns，无统计学意义。单因素方差分析采用Dunnett多重比较检验(a)，学生双尾非配对t检验(b, f和h)，双因素方差分析采用Sidak多重比较检验(c, i, k, l和m)。

图5。rg3以依赖evi1的方式介导CRLS1的上调。a,b) SH-SY5Y细胞用DMSO(0.1%)和Rg3 (5 μM)处理24 h，细胞用抗EVI1抗体(标尺= 30 μM)染色。蓝色表示细胞核a)。细胞核EVI1的平均荧光强度定量显示为b)。c,d) SH-SY5Y细胞的细胞核和细胞质蛋白部分在Scramble转染后用DMSO(0.1%)或Rg3 (5 μM)处理24小时。GRB2或TRKA sirna作用24小时。图中显示了核部分中fevi1和细胞质部分中GRB2和TRKA的代表性western blot图像(c)。EVI1水平的定量(d)。e-h) SH-SY5Y细胞用DMSO(0.1%)处理，用Scramble或EVI1 sirna转染24小时后，在Rg3 (5 μM)或Rg3 (5 μM)中进行24小时的免疫印迹检测。图中显示了核部分EVI1和细胞质部分CRLS1的代表性western blot图像(e)。fevi1水平的定量(f)和CRLS1水平的定量(g)。SH-SY5Y细胞线粒体CL的定量(h)。每种条件下进行三个独立实验在(a-h)中进行。代表性图像来自三个独立的实验(a)。i) CRLS1启动子中一个evi1结合位点、一对evi1结合位点引物和一对hnf1a结合位点引物示意图。j)通过EMSA验证了CRLS1启动子片段内的evi1结合基序。k,l) ChIP实验显示，Rg3 (5 μM)和抗evi1抗体处理SH-SY5Y细胞分离的DNA中CRLS1启动子富集。m - 0)转染Scramble或EVI1 sirna 24小时后，分别用pcDNA3.1(+)-EVI1或pcDNA3.1(+)-S728A-EVI1转染SH-SY5Y细胞，并分别用DMSO(0.1%)或Rg3 (5 μM)处理24 h。图中显示了核部分EVI1和细胞质部分CRLS1的代表性western blot图像(m)。EVI1水平(n)和CRLS1水平(o)的定量在(j-o)中执行。数据归一化为DMSO组(b、l、n和o)或Scramble_DMSO组(d、f、g和h)的数据。给出平均值的平均值±标准误差。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001, ns，无统计学意义。学生双尾非配对t检验(b, l)， Sidak多重比较检验(d, f, g, h, k, n和o)的双向方差分析。

图6 Rg3通过Grb2和Crls1缓解A53T-𝛼Syn-inducedmotor功能缺陷。a)评估rg3治疗效果的体内实验方案。解剖小鼠脑和SN作进一步分析。b)露天试验中的运动轨迹。c)在空地上行走的总距离。d)下降极点所需的时间。e)从旋转杆上掉下来的时间。(b-e)中，每组n = 10只。f - h) SN中具有代表性的crls -1、Th和Gapdh的western blot图像(f)。crls -1水平的定量(g)。Th水平的定量(h)。i)小鼠SN中线粒体CL水平。在(f-i)中进行了三个独立实验。j) th +神经元定量。k) th +神经元免疫组化染色(标尺= 100 μm;(j, k)中每组n = 3只小鼠。数据归一化为Vector_cmcNa组(g,h)。给出了平均值的平均值±标准误差。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001, ns，无统计学意义。采用Sidak多重比较检验的双向方差分析(c-e, g-j)。

图7 Rg3和左旋多巴在缓解A53T-𝛼Syn-Induced运动功能缺陷中的协同作用。a)研究rg3 (20mg kg - 1)和L-DOPA (20mg kg - 1)治疗效果的体内实验方案。解剖小鼠脑和SN作进一步分析。b)露天试验中的运动轨迹。c)在露天试验中行驶的总距离。d)撑杆试验下降时间。e)旋转杆试验中跌倒时间((b-e)每组n = 10只小鼠。f) TH+神经元免疫组化染色(比例尺= 100 μm)。g) TH+神经元的定量(n = 3micper group in (fand g))。给出平均值的平均值±标准误差。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析(c-e, g)。

图8 靶向TRKA-GRB2-CRLS1轴的TDF增强了CL表达，缓解了pd的症状。a) SPR技术筛选GRB2结合化合物的实验方案。b - d)用TDF (10 μM)或DMSO(0.1%)刺激SH-SY5Y细胞24小时。用抗GRB2抗体免疫沉淀细胞裂解物(b)进行Western blot，评估trka和EGFR的表达。定量trka水平(c)和EGFR水平(d)。e、f) crls1、GRB2、SH-SY5Y细胞在转染Scramble、GRB2或TRKA sirna 24小时后，分别用TDF (10 μM)或DMSO(0.1%)处理24小时。CRLS1水平的测定(f)。g) SH-SY5Y细胞在转染Scramble后，分别用TDF (10 μM)或DMSO(0.1%)处理24小时。GRB2或TRKA sirna 24 h。SH-SY5Y细胞线粒体CL的定量。在(b-g)中，每种情况下进行三个独立实验。h)露天试验中的运动轨迹。i)在开阔场地上行驶的总距离。j)从极点下降所需的时间。k)从旋转杆上掉下来所需的时间。(h-k)，每组10只。l) th +神经元免疫组化染色(比例尺= 100 μm)。m) TH+神经元定量。(1, m中每组n = 3只小鼠)。数据归一化为DMSO组(c,d)和Scramble_DMSO组(f)的数据。给出均值±标准误差。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001, ns，无统计学意义。学生双尾非配对t检验(c,d)， Sidak多重比较检验(f,g,i,j,k, m)的双向方差分析。

图9 Rg3和TDF触发GRB2与TRKA结合，促进ERK活化，导致EVI1转激活、CRLS1表达和CL生物合成的机制示意图。

本研究阐明了通过控制CRLS调控细胞CL水平维持的途径。trka - grb2ev1 - crls轴对pd的预防至关重要。在一项突破性的发现中，本研究已经确定了两种化合物，Rg3和TDF，作为一种显著形式的分子胶，擅长靶向和增强GRB2和TRKA之间的相互作用，从而调节这一途径并提高线粒体CL水平。通过其显著的神经保护作用，这些化合物显示出预防帕金森病的良好潜力。我们相信这项工作不仅对神经退行性疾病领域的研究人员有很大的兴趣，而且对脂质代谢和药物发现具有深远的意义。