Molecular Cancer|靶向肿瘤细胞外囊泡阻止肿瘤前巨噬细胞介导的结直肠癌肝转移

原发肿瘤细胞与远端器官免疫细胞或基质细胞之间的信息传递是形成转移前生态位(PMN)的关键因素。了解这一机制对于制定有效的肿瘤转移治疗策略至关重要。我们的研究旨在证明富含circ-0034880的肿瘤源性细胞外囊泡(TEVs)介导PMN的形成和结直肠癌肝转移(CRLM)的假设，靶向富含circ-0034880的TEVs可能是一种有效的治疗PMN形成和CRLM的策略。方法采用qPCR和FISH检测人结直肠癌血浆、原发性结直肠癌组织和肝转移组织中circRNAs的表达水平。此外，我们通过免疫荧光、RNA测序和体内实验来评估富集circ-0034880的TEVs对PMN形成和结直肠癌转移的影响机制。采用DARTS、CETSA和计算对接模型探讨人参皂苷Rb1阻碍PMN形成的药理作用。结果我们发现circ-0034880在CRC患者的血浆细胞外囊泡(EVs)中高度富集，并与CRLM密切相关。功能上，富含circ-0034880的tev进入肝组织，并通过血流被肝脏巨噬细胞吸收。机械上，tevs释放的circ-0034880增强了- SPP1highCD206+促肿瘤巨噬细胞的激活，重塑了支持转移的宿主

图1 circ -0034880富集的血浆EVs与CRLM相关。应用人类血液外泌体数据库(exoRBase)分析了12名结直肠癌患者和32名健康志愿者血浆EVs中差异表达的环状rna。红色表示高表达，蓝色表示低表达。每个单元的色彩亮度以倍数(log 2[AR/N])相关联。图中并非所有环状rna都被标记。使用GEO数据库中的B GSE159669阵列分析CRC原发肿瘤和配对癌旁组织中差异表达的环状rna。红色表示高表达，蓝色表示低表达。每个单元的色彩亮度以倍数(log 2[AR/N])相关联。图中并非所有环状rna都被标记。C通过文氏图法对血浆和组织之间的circrna进行交叉比较分析，筛选出顶部上调的circrna。红色代表CRC组织中表达上调的环状rna，蓝色代表CRC ev中表达上调的环状rna，粉色代表常见表达上调的环状rna。人结直肠癌细胞系和结肠上皮细胞NCM460细胞内空间和ev中13个表达上调的环状rna的D热图。通过电镜分析来自具有代表性的健康志愿者和CRC患者的EVs表型(纯度和形状)，红色箭头表示具有代表性的分离EVs。比例尺，100纳米。采用LM10纳米颗粒表征系统，分析了健康志愿者和结直肠癌患者的电动汽车的大小和颗粒数量。G健康志愿者和结直肠癌患者代表性EVs中TSG101、CD81和β-肌动蛋白的免疫印迹检测(H:健康志愿者;P:原发性CRC;M:转移性结直肠癌)。健康志愿者EVs (n = 21)中13个circrna的H qPCR验证和比例分析，原发性CRC (n = 60):未转移的CRC患者血浆，转移性CRC (n = 60):肝转移的CRC患者血浆。I健康志愿者(n = 21)、原发性CRC (n = 60)和转移性CRC (n = 60)的ev中circ-0034880的qPCR检测数据。circ-0034880在人结直肠癌细胞系EVs和结肠上皮细胞NCM460中的qPCR检测数据小鼠结肠癌细胞系MC38和结肠上皮细胞MODEK EVs中circ-0034880的K qPCR检测L、M FISH及circ-0034880在原发结直肠癌患者组织中的定量测定:原发结直肠癌患者无转移的组织，转移性结直肠癌患者肝转移的组织。标尺，50 μm。hhs -circ-0034880在代表性人CRC细胞系LoVo和结肠上皮细胞NCM460中的N - FISH检测。比例尺，25 μm。O FISH检测具有代表性的小鼠结肠癌细胞系MC38和小鼠结肠上皮细胞MODEK中免疫球蛋白-circ-0034880的表达。比例尺，25 μm

图2 circ -0034880富集的TEVs促进结直肠癌肝转移。tev生物分布观察动物模型建立流程图。B tev在小鼠潜在转移器官中的生物分布。显示了所示组小鼠的代表性生物发光图像。MC38细胞circ-0034880沉默效率的qPCR检测。D实验性肝转移动物模型建立流程图。E, F基于荧光素酶的生物发光成像对未处理ev、MODEK细胞衍生ev、富集circ-0034880的MC38细胞或沉默circ-0034880的MC38细胞的小鼠实验性肝转移的影响(图2C中的shRNA-1用于circ-0034880的K/D)。每组N = 6。所示组小鼠的代表性生物发光图像见图2E，定量数据(荧光强度)见图2F。G、I各组肝转移组织照相及定量n = 6。指示组肝组织代表性图像见图2G，定量数据(肝/体重，%)见图2I。图2H(上、中)为所示小鼠肝组织切片的代表性HE染色图。此外，使用抗ck20和抗glypican-3 (GPC-3)抗体的代表性免疫组化结果也如图2H所示，表明肝脏组织中肿瘤的转移源来自结肠组织(下)。HE染色结果的量化数据(肿瘤负荷，%)如图2J所示。比例尺，2mm(上)，500 μm(中)，40 μm(下)。所有结果均以mean±SD表示。采用学生t检验对数据进行分析。* p < 0.05;** p < 0.01

图3 富集circ -0034880的TEVs在肝脏转移前微环境中激活-CD206 +肿瘤前巨噬细胞。TEVs对肝脏转移前微环境影响的小鼠模型建立流程图。B多重免疫荧光法检测TEVs对转移前微环境中表型的总体影响(左:7天;右:14天)。切除肝组织用CD11B、CD206、α-SMA、Ly6G和CD3抗体染色。DAPI染色。比例尺，20 μm (D7)， 25 μm (D14)。C、D流式细胞术检测TEVs对肝脏转移前微环境巨噬细胞的影响(7天和14天)。图2E肝转移组织中circ-0034880的FISH和定量分析。标尺，50 μm。F图2E肝转移组织中tam的免疫荧光分析。6 μm O.C.T.组织冷冻切片用F4/80和CD206抗体染色。DAPI染色。标尺，50 μm。G、H、FISH和免疫荧光法检测TAMs中circ-0034880的表达形成具有代表性的临床原发性结直肠癌和结直肠癌肝转移灶。用CD86和CD206抗体染色检测tam，用FITC标记的circ-0034880探针检测circ-0034880。I上述tam中circ-0034880表达与CD206表达的相关性构成了具有代表性的临床原发性结直肠癌和结直肠癌肝转移病变。标尺，20 μm。所有结果均以mean±SD表示。采用学生t检验对数据进行分析。*， p < 0.05;**， p < 0.01

图4 富集circ -0034880的TEVs通过激活-CD206 +促肿瘤巨噬细胞促进CRC细胞迁移。共聚焦成像显示dir标记的ev(红色)传递到dio标记的bmdm(绿色)。比例尺，25 μm。B mc38 - ev或mc38shrna - ev处理48小时后，代表性bmms中circ-0034880的FISH检测。比例尺，25 μm。C qPCR检测mc38 - ev或mc38shrna - ev作用24 h和48 h的代表性bmms中circ-0034880的表达。D免疫荧光分析mc38 - ev或mc38shrna - ev作用bmms中- CD206+巨噬细胞。BMDMs用F4/80和CD206抗体染色。DAPI染色。比例尺，25 μm。E、F用MC38- ev或MC38shRNA- ev处理48小时的bmdm中巨噬细胞激活相关基因(Arg-1、CD206、VEGF、CD274、iNOS、H2-Ab1)的qPCR检测。G、h用IL-4、MC38- ev或MC38shRNA ev预处理或不预处理的bmdm中指定条件培养基(CM)处理MC38细胞的Transwell和伤口愈合实验。显示有代表性的图像，并对迁移的细胞进行计数。标尺:150 μm。标尺:150 μm。所有结果均以mean±SD表示。采用学生t检验对数据进行分析。*， p < 0.05;**， p < 0.01

图5 circ -0034880富集的TEVs通过保护SPP1免受miR-200a-3p和mir -141-3p介导的降解，促进- SPP1highCD206+促肿瘤巨噬细胞的激活。A、B mc38 - ev处理的BMDMs与对照BMDMs或mc38 - ev处理的BMDMs与mc38shrna - ev处理的BMDMs之间差异表达基因的log2倍变化(FC)和log10调整p值的火山图。mc38shrna - ev代表来自circ-0034880沉默的MC38细胞的ev。mc38 - ev处理的BMDMs中上调基因和mc38shrna - ev处理的BMDMs中下调基因的维恩图分析。D前30个上调和下调基因的热图。采用或不采用circ-0034880基因沉默处理的bmms中前10个差异表达基因的qPCR验证。用IL-4、mc38 - ev、MC38shRNA ev或不使用IL-4、mc38 - ev预处理的bmms中SPP1基因的qPCR检测G用IL-4、mc38 - ev或MC38shRNA ev或不使用IL-4、mc38 - ev或MC38shRNA ev预处理的bmdm细胞中SPP1的免疫印迹和定量分析。H用IL-4、mc38 - ev或MC38shRNA ev或不使用IL-4或mc38 - shrna ev预处理bmdm细胞SPP1的免疫荧光和定量分析。比例尺，25 μm。用IL-4、mc38 - ev或MC38shRNA ev或不使用IL-4、mc38 - ev预处理的bmdm上清液中SPP1水平的ELISA和定量分析。J图2E小鼠肝转移组织中SPP1和CD206的免疫荧光分析。本部分采用SPP1和CD206抗体。黄色箭头表示TAMs (- CD206+)中的SPP1，白色箭头表示整个TME间质中的SPP1。标尺，20 μm。使用K CircRNA相互作用组数据库和RegRNA分别预测circ-0034880和SPP1的潜在靶标mirna。Venn图显示了circ-0034880和SPP1相互推定的靶mirna。L MiR-200a-3p和miR-141-3p被选择作为circ-0034880和SPP1之间的潜在桥梁。M在H293T细胞中通过RIP和qPCR证实circ-0034880与AGO2蛋白相互作用。利用抗ago2免疫沉淀物通过qPCR检测与circ-0034880结合的N个潜在miRNAs (miR-200a-3p和miR-141-3p)。在共转染circ-0034880-WT或circ-0034880-MUT和miR-200a-3p/miR-141-3p模拟物后，在H293T细胞中测量荧光素酶报告细胞活性。在共转染SPP1 3'UTR-WT或SPP1 3'UTR-MUT和miR-200a-3p/miR-141-3p模拟物后，在H293T细胞中测量P荧光素酶报告细胞活性。所有结果均以mean±SD表示。采用学生t检验对数据进行分析。*， p < 0.05;**， p < 0.01

图6 Rb1通过阻断富含circ-0034880的TEVs介导的- SPP1highCD206+促肿瘤巨噬细胞的激活，阻止CRC细胞迁移。A采用qPCR方法检测了71种天然产物对circ-0034880表达的影响。热图显示了不同天然产物对circ-0034880表达的抑制程度。B通过NanoSight分析了所选4种天然产物对MC38 TEVs分泌的影响。C天然产物人参皂苷Rb1的三维分子结构图。D、E、FISH及基因沉默和人参皂苷Rb1对MC38细胞circ-0034880表达影响的定量分析。比例尺，25 μm。基因沉默和/或人参皂苷Rb1预处理MC38细胞衍生的ev中circ-0034880表达的qPCR分析G、H、FISH及不同ev预处理对BMDMs中circ-0034880表达影响的定量分析。比例尺，25 μm。qPCR检测不同ev预处理对BMDMs中circ-0034880表达的影响。J, K DMEM、mc38 - ev、mc38shrna - ev、Rb1 + mc38shrna - ev处理BMDMs后CD206和SPP1的免疫荧光和定量分析。比例尺，25 μm。L ELISA检测经DMEM、mc38 - ev、mc38shrna - ev或Rb1 + mc38shrna - ev处理的bmms上清液中分泌SPP1蛋白。用DMEM、mc38 - ev、mc38shrna - ev或Rb1 + mc38shrna - ev处理的bmms中SPP1的qPCR检测。DMEM、mc38 - ev、mc38shrna - ev或Rb1 + mc38shrna - ev处理的bmdm中巨噬细胞活化相关基因(Arg-1、CD206、iNOS)的qPCR检测。不同ev预处理BMDMs培养上清对结直肠癌细胞迁移影响的Transwell及创面愈合实验。标尺:150 μm。所有结果均以mean±SD表示。采用学生t检验对数据进行分析。*， p < 0.05;**， p < 0.01

图7 Rb1直接与QKI结合，抑制circ-0034880的生物发生。采用dart实验在MC38细胞中寻找Rb1的直接靶点。rb1处理的MC38细胞与对照MC38细胞差异蛋白的log2倍变化(FC)和log10调节p值的火山图。红点表示rb1处理的MC38细胞中蛋白上调;蓝点表示MC38细胞中上调的蛋白质。B rb1处理的MC38细胞和对照MC38细胞的DARTS法表达上调和下调蛋白的热图。Rb1靶蛋白(n = 151)和circRNAs生物发生相关蛋白(n = 17)的C - Venn图分析。D md优化后与人参皂苷Rb1结合的QKI (Q9QYS9，残基14-203)复合物结构立体图及与人参皂苷Rb1的详细相互作用。E人参皂苷Rb1的RMSD分析符合QKI的主干。F, G CETSA实验在热力学水平上评价Rb1与QKI的结合。western blot检测QKI蛋白表达水平。利用Rb1浓度增加的QKI全长蛋白进行hspr。根据反应-浓度曲线计算平衡解离常数(KD)。1 .计算对接模型显示QKI蛋白中存在Rb1药物结合域，QKI蛋白与Rb1药物结合域共享相同的RNA结合域。从ENCORI中获得QKI基序，在circ-0034880的侧翼发现多个QKI结合序列。采用qPCR和western blot方法检测QKI沉默MC38细胞和对照MC38细胞中QKI mRNA和蛋白的表达。用qPCR方法检测qki沉默MC38细胞和对照MC38细胞中circ-0034880的表达。所有结果均以mean±SD表示。采用学生t检验对数据进行分析。*， p < 0.05;**， P < 0.01。

图8 Rb1通过阻断富含circ-0034880的TEVs介导的- SPP1highCD206+促肿瘤tam的激活来抑制CRLM。Rb1干预小鼠实验性肝转移模型的流程图。B, C基于荧光素酶的生物发光成像对实验小鼠肝转移的影响不含EVs或由富含circ-0034880的MC38细胞衍生的EVs，或circ-0034880沉默的MC38细胞或Rb1处理。每组N = 6。所示组小鼠的代表性生物发光图像见图8B，定量数据(荧光强度)见图8C。D、E、F、G照片及HE染色观察Rb1对小鼠结肠癌肝转移的影响。比例尺，2mm(上)，500 μm(下)。每组N = 6。所示组小鼠代表性肝脏组织图像见图8D，定量数据(肝/体重，%)见图8F。图8E(上、中)为所示小鼠肝组织切片的代表性HE染色图。此外，使用抗ck20和抗glypican-3 (GPC-3)抗体的代表性免疫组化结果也如图8E所示，表明肝脏组织中肿瘤的转移源来自结肠组织(下)。HE染色结果的量化数据(肿瘤负荷，%)如图8G所示。比例尺，2mm(上)，500 μm(中)，40 μm(下)。H以上Rb1干预模型肝转移组织中tam的免疫荧光分析。标尺，50 μm。I Rb1干预模型肝转移组织中circ-0034880的FISH检测。比例尺，25 μm。J Rb1干预模型肝转移组织中SPP1的免疫荧光分析。标尺，20 μm。K, L, M . Fig. 8H, I, J. N . A .原发性结直肠癌细胞与远处肝器官巨噬细胞相互作用的机制示意图。所有结果均以mean±SD表示。采用学生t检验对数据进行分析。*， p < 0.05;**， p < 0.01

总之，本研究阐明了富含circ-0034880的TEVs通过增强-SPP1highCD206 +促肿瘤巨噬细胞的激活，从而重塑肝脏微环境以支持PMN的形成，从而促进CRLM的作用。本研究结果表明人参皂苷Rb1可以作为一种潜在的治疗药物。Rb1通过直接靶向QKI蛋白重塑TME，从而减少circ-0034880的生物发生，抑制-SPP1highCD206 +促肿瘤巨噬细胞的活化，最终抑制CRLM。这些发现为通过靶向TME重塑过程来对抗结直肠癌转移提供了新的治疗途径。