摘要
背景：脓毒性心肌病 （SCM） 是严重脓毒症患者心肌损伤的一种并发症。
目的：本研究揭示了黄芪甲苷 IV（AS） 治疗脓毒性心肌病的潜力，为开发靶向 DUSP1-PHB2 相关线粒体-ER 相互作用的心脏保护药物提供参考。
方法：双特异性磷酸酶-1 （DUSP1）/禁止蛋白 2 心肌细胞特异性敲除小鼠 （DUSP1/PHB2CKO） /DUSP1 转基因小鼠 （DUSP1/PHB2TG） 生成 LPS 诱导的脓毒症模型。使用心脏超声、荧光染色、透射电子显微镜和蛋白质印迹法检测 AS-IV 改善心脏损伤的病理机制。用 DUSP-1/PHB2 处理心肌细胞 siRNA 后，使用 qPCR、western blotting、ELISA 和激光共聚焦显微镜测定线粒体功能和形态的变化，并进一步检查 AS-IV 的靶向治疗效果。
结果：SCM 治疗会导致严重的线粒体功能障碍。然而，黄芪甲苷 IV （AS） 治疗使线粒体稳态和 ER 功能正常化。但是，保护作用在 DUSP1/Prohibitin 2 心肌细胞特异性敲除小鼠 （DUSP1/PHB2CKO） 中被阻断，但在 DUSP1 转基因小鼠 （DUSP1/PHB2TG） 中不受影响。
结论：本研究揭示了 AS 治疗脓毒性心肌病的潜力，为开发靶向 DUSP1-PHB2 相关线粒体-ER 相互作用的心脏保护药物提供了参考。
图文简介
图1. 单细胞测序分析显示细胞类型分布和基因表达发生显著变化。（A） UMAP 显示心肌组织中不同细胞类型的分布。不同的颜色代表不同的细胞类型，包括毛细血管 EC、动脉 EC、巨噬细胞、B 细胞、心肌细胞、静脉 EC、T 细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞 （VSMC）、神经元、NK 细胞和中性粒细胞。（B） 热图显示了 SCM 组和正常组中不同细胞类型的基因表达。每个方块代表基因在特定细胞类型中的表达水平，颜色越深，表达水平越高。（C） UMAP 显示正常组和 SCM 组中不同细胞类型的分布差异。（D-E）正常组和 SCM 组中基因 DUSP1 和 PHB2 的表达。每个点代表一个细胞，颜色越深，基因表达水平越高。（F） SCM 组和正常组不同细胞类型中基因 DUSP1 的表达比较。（G） SCM 组和正常组不同细胞类型中 PHB2 基因表达的比较。
图2. 单细胞测序揭示了调节脓毒性心肌病表型的机制。（A-C）基因本体论 （GO） 分析结果，显示细胞成分 （CC）、生物过程 （BP） 和分子功能 （MF） 相关通路的富集。（A） 细胞成分 （CC） 分析。（B） 生物过程 （BP） 分析。（C） 分子功能 （MF） 分析。（D-H）基因集富集分析 （GSEA） 结果，显示 SCM 组中不同通路的富集。（I-R）相关性分析显示 DUSP1 和 PHB2 基因表达与不同通路富集评分的相关性。（I） DUSP1 与 UPR 通路富集评分 （AUC） 之间存在显著负相关。（J） DUSP1 与线粒体裂变途径富集评分 （AUC） 之间存在显著负相关。（K） DUSP1 与细胞凋亡途径富集评分 （AUC） 之间存在显著负相关。（L） DUSP1 与 OXPHOS 通路富集评分 （AUC） 之间存在显著负相关。（M） DUSP1 与自噬途径的富集评分 （AUC） 呈显著正相关。（N） PHB2 与线粒体生物发生途径的富集评分 （AUC） 呈显著正相关。（O） PHB2 与线粒体融合途径的富集评分 （AUC） 呈显著正相关。（P） PHB2 与自噬途径的富集评分 （AUC） 呈显著正相关。（Q） PHB2 与 UPR 通路的富集评分 （AUC） 呈显著负相关。（R） PHB2 与 ROS 生成途径的富集评分 （AUC） 呈显著负相关。
图3. 黄芪甲苷 IV 通过 DUSP1-Prohibitin 2 （PHB2） 改善 SCM 心肌炎症损伤。（A） 免疫荧光染色显示心脏组织中 Tnt 和 Gr-1 的表达。图像显示了对照组 （Ctrl）、LPS 处理组和不同浓度 AS （AS-L、AS-M 和 AS-H） 处理后的表达变化。（B） 检测小鼠体内 Gr-1 水平。比例尺，150 μm。（C-E）采用 DUSP1/PHB2 （F-H） 超声心动图的蛋白表达和转录水平检测分析小鼠的心脏功能。分析的参数包括左心室射血分数 （LVEF%） 、FS% 和 LVDd。（I-K） 检测血清心肌损伤标志物水平，包括肌酸激酶同工酶 （CK-MB） 、乳酸脱氢酶 （LDH） 和肌钙蛋白 （TnT）。（L-N）分析炎症因子水平，检测 MMP-9、白细胞介素-10 （IL-10） 和白细胞介素-17 （IL-17） 的变化。（O-Q）线粒体途径坏死性凋亡介导基因 （Caspase-3/-9/-12） 的转录水平检测。
图4. 黄芪甲苷 IV 通过线粒体自噬和 UPRmt 的协同作用抑制脓毒症诱导的心肌损伤后的细胞焦亡。（A） 免疫荧光染色显示心脏组织中 Tnt 和 Gr-1 的表达 （DAPI 用作内部参考）。比例尺，150 μm。（B - D）超声心动图用于分析小鼠的心脏功能。分析的参数包括左心室射血分数 （LVEF%） 、FS% 和 LVDd。（E-G） 测量血清心肌损伤标志物，包括肌酸激酶同工酶 （CK-MB） 、乳酸脱氢酶 （LDH） 和肌钙蛋白 （TnT）。（H-J）细胞凋亡相关指标分析，包括 caspase-1 、 caspase-3 和 caspase-9 的表达水平。（K-M）自噬相关基因的表达水平，包括 FUNDC1、ATG5 和 ATG12。（N-R）线粒体 UPR 相关基因的转录水平。（S）PHB2 转录水平 （T-O） 检测细胞焦亡和线粒体自噬相关蛋白的表达水平。
图5. 黄芪甲苷 IV 治疗 LPS 诱导的心肌细胞线粒体功能障碍。对照组 （Control） 和高浓度黄芪甲苷 IV （AS-H） 治疗组为对照。LPS 治疗组，以及在特定条件下用低、中、高浓度黄芪甲苷 IV （AS-L、AS-M 和 AS-H） 治疗后每组炎症损伤的变化。（A） 心肌细胞骨架蛋白的稳定性测试。比例尺，25 μm。（二）CCK8 细胞活性检测。（D，E）线粒体氧化应激相关指标分析。分析的参数包括 ROS 的表达水平和丙二醛 （MDA） 活性。（F，G）抗氧化酶活性分析。分析的参数包括超氧化物歧化酶 （SOD） 活性和谷胱甘肽过氧化物酶 （GPX） 活性。（H-J）线粒体复合物活性和 ROS 分析比例尺，150 μm。分析的参数包括复合物 III （Complex-III.）/复合物 V （Complex-V.） 的活性变化和 ROS 表达。（K-L）DUSP1 的表达水平/转录水平。比例尺，150 μm。（米）PHB2 的转录水平。（N）CCK8 检测细胞活性（DUSP1 基因修饰）。（O）PHB2 的转录水平;（P-S）与细胞焦亡相关的调节基因的转录水平;
图6. 黄芪甲苷 IV 通过 PHB2 治疗 LPS 诱导的心肌细胞 MQS 功能障碍。（A-C）线粒体氧化应激损伤 （ROS/SOD/GSH） 比例尺，150 μm。（D-E）线粒体呼吸链复合物的检测。（F-J）线粒体能量代谢水平的检测。比例尺，150 μm。（K-N）线粒体膜电位水平检测 （JC-1）。（O）内质网结构完整性测试。比例尺，25 μm。（P-R）检测调节线粒体生物合成的基因的转录水平。（S-Y）线粒体动力学（融合/裂变）相关基因转录水平和线粒体结构完整性检测比例尺，25 μm
图7. 黄芪甲苷 IV 通过 DUSP1-PHB2 相互作用治疗 LPS 诱导的骨骼蛋白损伤。（A，F-G）检测内质网自噬、荧光和相关基因转录水平。比例尺，150 μm。（B-E）内质网应激相关基因的转录水平。（H-M）线粒体未折叠蛋白反应相关基因的转录水平检测。（N-O）TOM2 荧光激光共聚焦检测（线粒体自噬标志物）。比例尺，150 μm..（P-Q）检测线粒体自噬相关基因。（R） 心肌细胞骨架蛋白完整性的检测。比例尺，25 μm。（S-V）LPS 处理前后心肌细胞的转录组学检测 （线粒体/内质网相关基因富集分析）。
图8. 黄芪甲苷 IV 通过 DUSP1-PHB2 相互作用对 SCM 心肌细胞损伤的治疗机制分析。（A） 黄芪甲苷 IV 处理前后基因位点差异的火山图 （B） 线粒体氧化应激/氧化磷酸化水平的转录组学富集分析 （C-E） 焦亡/线粒体融合/线粒体自噬/内质网应激/细胞凋亡/未折叠蛋白反应差异分析的富集基因分析 （F） DUSP1 和 PHB2 蛋白之间分子对接的预测 （G） 分子对接的预测黄芪甲苷 IV 和 DUSP1 蛋白 （H） 黄芪甲苷 IV 和 PHB2 蛋白分子对接的预测 （I） B2-DUSP1 相互作用机制对黄芪甲苷 IV 改善细胞骨架蛋白损伤的影响;比例尺，25 μm。
图9. 黄芪甲苷 IV 通过 DUSP1-PHB2 相互作用治疗 LPS 诱导的心肌细胞 MQS 功能障碍。（A） TOM20 （激光共聚焦检测） 比例尺的荧光表达，150 μm。（B、G-I、U）线粒体生物合成相关蛋白的表达水平 （CF，U） 线粒体自噬相关蛋白和基因表达水平的检测 （JN） 线粒体动力学（融合/裂变）相关基因转录水平和线粒体结构的检测（线粒体追踪器） 比例尺，25 μm。（O-P）检测 DUSP1 比例尺 （100 μm） 的荧光表达和转录水平;（Q-T）线粒体能量代谢检测
图 10.黄芪甲苷 IV 通过 DUSP1-PHB2 相互作用治疗 LPS 诱导的心肌细胞 ER 自噬。（A-B）内质网的激光共聚焦检测。比例尺，25 μm （C-E） 复合物 I/III/V 活性检测;（F） 检测 VDAC1 转录水平;（G） mPTP 开放水平检测;（H-M）检测与线粒体未折叠蛋白反应相关的基因的转录水平;（N） 检测泛细胞凋亡相关调节蛋白的表达水平;（O） 内质网自噬表达水平的检测;比例尺，125 μm （PS） 检测泛细胞凋亡相关基因的转录水平。
图11. 黄芪甲苷 IV 通过 DUSP1-PHB2 治疗脓毒性心肌炎损伤改善心肌功能。（A） 免疫荧光染色显示心脏组织中 Tnt 和 Gr-1 的表达 （DAPI 用作内部参考染色）。比例尺，150 μm （B-D） 超声心动图用于分析小鼠的心脏功能。分析的参数包括左心室射血分数 （LVEF%） 、FS% 和 LVDd。（E-G） 检测血清心肌损伤标志物水平，包括肌酸激酶同工酶 （CK-MB） 、乳酸脱氢酶 （LDH） 和肌钙蛋白 （TnT）。（H-J）细胞凋亡相关指标分析，包括 caspase-1 、 caspase-3 和 caspase-9 的表达水平。（K-P）检测与线粒体未折叠蛋白反应相关的基因的转录水平。（T-U）检测与线粒体动力学和内质网应激相关的蛋白质的表达水平
结论
本研究通过使用野生型 （WT） 和转基因小鼠的 SCM 体内和体外模型，阐明了 DUSP1-PHB2 在 SCM 相关心肌损伤发病机制中的关键调节作用以及 AS 的靶向治疗效果。本研究结果表明 DUSP1-PHB2 表达失调是导致 SCM 中线粒体质量控制功能障碍和内质网自噬的关键上游调节机制。AS 有效改善心肌炎症损伤，抑制心肌细胞凋亡，保持线粒体稳态，使内质网自噬正常化，并通过这些途径保护受损的心肌。这些发现为 SCM 治疗药物的开发和临床策略提供了有价值的见解。
DOI: 10.1016/j.jare.2024.10.030
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