论文荐读
质粒复制原点在地衣芽孢杆菌中的功能鉴定及理性设计
作者：张高阳1,2，李由然1,2*，肖丰旭1,2，石贵阳1,2
单位：
1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122
2.江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，江苏 无锡，214122
基金项目：
国家重点研发计划（2020YFA0907704）；国家自然科学基金（32172174）
摘要及关键词
摘要：食品安全级工业微生物地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）与模式微生物相比，严重缺乏质粒载体等合成生物学标准化遗传工具，导致其研究与应用受到限制。该研究首先建立了质粒特性在地衣芽孢杆菌中的评价方法，由此鉴定获得了高效复制原点。在此基础上进一步解析了复制原点中茎环结构影响质粒拷贝数和稳定性的分子机制，并理性设计了系列人工复制原点。结果表明，枯草芽孢杆菌来源的复制原点ORIT5拷贝数是pHY300内源复制原点的2.15倍（达到40.2），同时具有更高的稳定性。3’端增加1个motif为TCCGCC茎环的人工复制原点pT1，拷贝数进一步提升至62.2，稳定性提高36%。以麦芽寡糖基海藻糖合成酶为报告蛋白，携带pT1复制原点的重组菌发酵最高酶活力达到8 726.7 U/mL，比出发菌株提高了43.9%。人工复制原点的开发与应用为地衣芽孢杆菌表达系统的改进和完善奠定了基础。
关键词：复制原点；地衣芽孢杆菌；茎环；麦芽寡糖基海藻糖合成酶
主要结论
本研究基于文献调研，以拷贝数，稳定性为参考指标，建立了质粒特性的评价方法。筛选出的来源于枯草芽孢杆菌的复制原点ORIT5介导的表达系统在保持原有质粒稳定性基本不变的前提下，其拷贝数是pHY300 内源复制原点介导表达系统的2.15倍，达到了40.2。
在此基础上利用基因工程策略通过改变茎环数量跟位置构建了一系列复制原点，发现改造后复制原点pT1介导表达系统的酶活力在原有pS5基础上提高了54.7%，最高达到8726.7 U/mL。在先前的研究中，相同来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶在地衣芽孢杆菌中的胞外酶活力为6 065.9 U/mL。本研究地衣芽孢杆菌重组菌酶活力相较之前提高了43.9%，表明地衣芽孢杆菌作为食品酶生产宿主具有一定的工业应用价值，同时本研究为复制原点的改造以及安全表达系统的开发提供了实验数据及理论参考。
a-模体的筛选;
b-茎环个数与拷贝数之间的关系;
c-茎环个数与稳定性之间的关系
图2 人工复制原点的构建
a-天然复制原点的拷贝数比较;
b-天然复制原点的稳定性比较
c-人工复制原点的拷贝数比较
d-人工复制原点的稳定性比较
图3 复制原点的拷贝数和稳定性比较
a-天然复制原点对MTSase功能表达的影响
b-人工复制原点对重组菌生长的影响
c-发酵液蛋白SDS-PAGE电泳图
图4 重组菌的酶活测定
表4 五种重组质粒所介导分泌的MTSase蛋白含量
团队简介
团队多年来一直致力于安全型合成生物底盘细胞（地衣芽孢杆菌、酿酒酵母）；大宗发酵产品原料精细化处理技术以及发酵过程多参数在线检测和智能模拟技术的研究。在工程化研究方面包括：（1）建立重大淀粉酶品的绿色制造技术。（2）基于碳代谢调控的食品级人工表达元件和基于细胞内信号反馈的发酵过程代谢控制。在应用基础研究方面包括：（1）构建了糖代谢氧化还原平衡且阻断了甘油合成的酒精酵母细胞；（2）解析了地衣芽孢杆菌中质粒元件的分子作用机制,实现了麦芽寡糖基海藻糖合成酶、半乳糖苷酶等基因在地衣芽孢杆菌中的高水平表达。近年来，在国内外学术期刊发表论文100余篇；授权专利90余项，主持国家和省部级项目15余项。除此之外，已服务企业20余家，涵盖酒精、D-阿洛酮糖、酶制剂、生物制药等行业，且10多项技术已进入中试或产业化阶段。
通
信
作
者
李由然，工学博士，教授，硕士生导师。生物工程学院微生物发酵过程工程研究团队成员，多年来一直致力于地衣芽孢杆菌的合成生物学研究。地衣芽孢杆菌是被众多国际机构认定为食品安全的工业微生物，是开发安全高效表达系统的理想宿主菌，相关核心上游技术主要被欧洲、美国和日本等国的公司所垄断。对照国外技术水平，地衣芽孢杆菌表达系统的构建及应用主要存在三方面挑战：遗传改造困难、生物元件缺乏和发酵方法落后。针对这些问题，多年来进行了以下关键技术的攻关：基于条件表达的CRISPR基因编辑技术、基于碳代谢调控的食品级人工表达元件和基于细胞内信号反馈的发酵过程代谢控制。完整构建了地衣芽孢杆菌安全高效表达系统。近年来，承担和完成国家重点研发计划2项、国家自然科学基金2项及横向项目10余项；在国内外学术期刊发表论文60余篇（其中SCI收录40余篇）；授权国家发明专利12项。获包括中国轻工业联合会科技进步一等奖在内的科技奖项3项。
引用格式
张高阳,李由然,肖丰旭,等.质粒复制原点在地衣芽孢杆菌中的功能鉴定及理性设计[J].食品与发酵工业,2024,50(18):1-8.
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