封面文章
HIP1过表达对酿酒酵母工程菌麦角硫因产量的影响
作者：王文欣，王文悦，刘子雄，上官玲玲，张辉燕，安斐然，陈雄，代俊*
单位：
湖北工业大学 生物工程与食品学院，发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，工业微生物湖北省重点实验室
基金项目：
国家自然科学基金项目（31871789，41876114）；湖北省科技攻关计划项目（2020BGC010）
摘要及关键词
摘要：麦角硫因是一种普遍存在于高等动植物体内的天然抗氧化剂，具有减少细胞氧化损伤、抗炎和治疗相关疾病的能力，被广泛应用于食品、化妆品和医药行业。与传统的植物提取法及化学合成法相比，通过微生物合成法制备麦角硫因具有周期短、成本低和产量高等优势。该研究以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D为出发菌株，利用CRISPR/Cas9系统向其基因组中引入异源酶基因，构建具有完整麦角硫因生物合成途径的酿酒酵母工程菌。为进一步提高其产量，过表达组氨酸特异性转运蛋白Hip1p后，在仅有0.5 mmol/L组氨酸供给条件下，菌株胞内游离组氨酸水平显著提高，且麦角硫因产量提高10%。最终经摇瓶发酵72 h产量达（6.88 ± 0.11） mg/L，而在5 L罐补料分批发酵策略下，培养72 h后麦角硫因产量达237.34 mg/L。该研究为后续代谢工程改造产麦角硫因酿酒酵母工程菌株提供靶基因参考。
关键词：酿酒酵母；麦角硫因；异源表达；生物合成；组氨酸转运；补料分批发酵
主要结论
本研究选择了来自粗糙脉孢霉（Neurospora crassa）的Egt1基因(GenBank accession: XP_956324.3)和来自麦角菌（Clavieps purpurea）的CpEgt2基因（GenBank accession: CCE33140.1）作为异源基因组合，同时将基因依照酿酒酵母密码子偏好性进行了优化，并将采用组成型启动子的完整基因表达盒整合进酿酒酵母基因组中，最终获得E1和E2两株酿酒酵母工程菌。E1和E2在相同条件下培养48 h，HPLC检测到E2菌株麦角硫因产量较E1产量显著提高了 40.56%（图1-c）。结果说明异源基因NcEgt1和CpEgt2均能够在酿酒酵母细胞内正确表达并催化相应反应发生，使酿酒酵母工程菌株合成异源产物麦角硫因。
图1 重组菌株 PCR 验证及麦角硫因产量对比图
Fig. 1 PCR validation of recombinant strains and comparison of ergothioneine production
注：*-P<0.05, **-P<0.01, ***-P<0.001, ****-P<0.000 1（下同）。
图2 重组菌株中麦角硫因的LC-MS分析
Fig. 2 LC-MS analysis of ergothioneine from recombinant strain
麦角硫因的合成涉及多种前体氨基酸，其中组氨酸是其结构的基础，提高胞内组氨酸水平可能是麦角硫因产量提高的关键。为了提高酿酒酵母E2胞内组氨酸水平，将1种已知内源性的编码组氨酸高亲和力渗透酶的基因HIP1 利用启动子TEF1表达，在酵母Ⅹ号染色体上插入1个拷贝，得到HIP1过表达菌株E3，并通过实时荧光定量PCR实验对HIP1表达水平进行检验（图3-a），菌株E3 中HIP1表达水平相较E2有显著提高，表明E3菌株中HIP1 基因成功过表达。随后进行摇瓶发酵，探究 HIP1过表达对麦角硫因产量及细胞生长的影响。过表达HIP1基因对细胞生长基本没有影响，但E3菌株麦角硫因最终产量并没有提高（图3-b）。此外，菌株于 48~72 h期间麦角硫因大量合成，而此阶段两个麦角硫因合成基因的表达并没有明显提高（图3-c），表明麦角硫因作为次级代谢产物更易于稳定期合成。
图3 菌株 E2,E3 摇瓶发酵及 RT-qPCR 实验结果
Fig. 3 Shake flask fermentation results of strain E2, E3 and RT-qPCR results
为探究组氨酸供给对HIP1过表达菌株麦角硫因产量的影响，研究团队向培养基中额外添加了76 mg/L的组氨酸，菌株E3的生物量和麦角硫因产量相较于E2在生长各个阶段均有所提高（图4-a）。菌株E3的麦角硫因产量在 48 h 时提高了 11.6%，且在72 h时，产量达到（6.88 ± 0.11）mg/L，相较E2提高了9.6%。此外，进一步分析了在组氨酸供给条件下HIP1基因和麦角硫因合成酶基因的表达情况，在48 h和72 h时，E3 菌株中HIP1基因表达量有显著提高，而麦角硫因合成途径中两个关键基因的表达量相较于E2基本保持一致（图4-b），说明在组氨酸供给条件下，HIP1 过表达有助于麦角硫因产量的提高。
为了进一步分析 Hip1p 蛋白对组氨酸的转运情况，测量了发酵期间不同时间点菌株胞内外游离组氨酸含量（图4-c,图 4-d）。可观察到，菌株E3在12~48 h 胞内氨基酸水平显著高于E2，在72 h却略低于E2，这可能是由于菌株E3在稳定期大量合成麦角硫因，导致胞内游离组氨酸快速消耗造成；同时，E3 胞外氨基酸也在各时间点低于E2，说明在供给一定量组氨酸的条件下，过表达HIP1工程菌能有效转运胞外组氨酸至胞内，提高胞内组氨酸水平，从而有助于提高麦角硫因产量。
图4 组氨酸供给条件下菌株发酵结果
Fig. 4 Fermentation results under histidine supply
最后，为了评估过表达HIP1对菌株在补料分批发酵条件下麦角硫因产量的提升作用，对菌株E2和E3进行了5 L发酵罐的补料分批发酵。为获得更高产量，对组氨酸进行补加，摇瓶发酵结果显示24 h时，培养基中组氨酸基本耗尽，因此补料分批发酵过程中于24 h一次性补加组氨酸0.5 mmol/L。结果如图 5 所示，菌株E2经72 h发酵，麦角硫因产量达 215.01 mg/L，菌体OD600达65.5，胞内组氨酸含量于28 h达到最高299.14 mg/L，而 HIP1过表达菌株E3发酵72 h麦角硫因产量为 237.34 mg/L，较E2提高10.39%，菌体 OD600达69.4，胞内组氨酸含量于32 h达到最高898.86 mg/L。在整个发酵过程中，菌株 E3胞内组氨酸含量在各个时间点均高于E2，其中在4~48 h内尤为明显，为菌株E2的 2.1~3.7倍；此外，生物量、残糖等参数两菌株基本一致，说明在发酵罐水平下，过表达 HIP1仍能有效提高胞内组氨酸含量，从而实现麦角硫因的高效生产。
图5 工程菌株补料分批发酵产麦角硫因
Fig. 5 Fed-batch fermentation of engineered strain for production of ergothioneine
团队简介
通
信
作
者
代俊，现任湖北工业大学生命科学与健康工程学院副院长，微生物学博士，副教授，担任湖北省合成生物学会常务理事、中国医药教育协会食品卫生安全教育专业委员会专家委员，Frontiers in Bioengineering and Biotechnology专刊编辑，Frontiers in Microbiology、Food Bioscience、Current Microbiology、Food Biotechnology等杂志审稿人；研究方向为酵母合成生物学，重点围绕酿酒酵母胁迫适应机制、系统代谢工程改造生产芳香族天然化合物、酿酒酵母的诱变育种选育及发酵调控、发酵食品工艺改造与品质提升等研究。主持国家自然科学基金等各类项目10余项，发表SCI论文30余篇，授权发明专利10余项；获湖北省高等学校教学成果奖三等奖，指导学生多次获得国际遗传工程机器大赛金奖、全国大学生生命科学竞赛一等奖等；获湖北工业大学师德标兵、优秀共产党员等荣誉。
第
一
作
者
王文欣，湖北工业大学生命科学与健康工程学院2021级硕士研究生，发酵工程专业。研究方向：酵母合成生物学。
引用格式
王文欣, 王文悦, 刘子雄, 等. HIP1过表达对酿酒酵母工程菌麦角硫因产量的影响[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(15): 8-15.
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图文供稿| 作 者
编辑排版| 郑 越
内容审核| 陈雅薇
