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枯草芽孢杆菌高效分泌表达盒的构建和应用
作者：韩瑞1,2,3，初文琴1,2,3，刘振1,2,3*
单位：
1.中国海洋大学 食品科学与工程学院，海洋食品加工与安全控制国家重点实验室
2.青岛市食品生物技术重点实验室
3.中国轻工业水产品生物加工重点实验室
基金项目：
国家自然科学基金项目（32172178）
摘要及关键词
摘要：该工作旨在研究枯草芽孢杆菌表达系统中不同元件之间的适配性，从而构建高效蛋白分泌载体，并进一步应用于提高壳聚糖酶Csn21c的胞外表达量。首先，构建包含不同启动子（P43、Pshuttle09）、核糖体结合位点（RBS1、RBS5）和信号肽（SnprB、SphoD、SymzC）的12个质粒，并分别以3种蛋白（琼胶酶AgWH50C、壳聚糖酶Csn21c和脂肪酶Lip15）为指示蛋白比较不同元件组合的蛋白分泌水平，发现载体pP435Y*K（P43-RBS5-SymzC）和pP095P*K（Pshuttle09-RBS5-SphoD）优于其他载体。相较原载体（pP431N*K），载体pP435Y*K能使琼胶酶AgWH50C酶活性提高184.25%，脂肪酶Lip15酶活性提高52.8%，壳聚糖酶Csn21c酶活性提高164.62%。最后，通过比较5种不同培养基，确定了TB培养基为壳聚糖酶Csn21c的最适发酵培养基，使用TB培养基壳聚糖酶Csn21c的最高酶活达到21.14 U/mL，较LB培养基的酶活提高了128.31%。
关键词：枯草芽孢杆菌；分泌；启动子；核糖体结合位点；信号肽；壳聚糖酶
主要结论
1、在本研究中，以3种蛋白作为指示蛋白，比较了12种不同的表达元件组合。由图1可知，启动子Pshuttle09的转录效率高于P43，在翻译效率方面，RBS5优于RBS1。而载体pP091Y*K和pP095Y*K表达指示蛋白的能力较低，其原因可能是Pshuttle09和Symzc的适配性较低。pP435Y*K和pP095P*K是对3种蛋白均具有强表达效果的载体，因此二者有望成为对多种蛋白均具有强分泌效果的通用载体。
图1 12个表达盒对3种不同蛋白的表达效果
Fig.1 The expression effect of 12 expression boxes on 3 different proteins
2、进一步通过SDS-PAGE的方法确定较好用的载体pP095PCK表达的壳聚糖酶Csn21c在细胞外和细胞内的表达量均高于原载体pP431NCK。因此，载体pP095PCK可以提高转录和翻译水平，进一步提高外源表达量。
图2 载体pP431NCK和pP095PCK细胞内外壳聚糖酶Csn21c表达的SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of extracellular and intracellular chitonsanase Csn21c expression by pP431NCK and pP095PCK
3、本文比较了5种培养基（LB培养基、TB培养基、SOC培养基、SR培养基和ZTY培养基）对pP095PCK质粒表达壳聚糖酶Csn21c的影响。TB培养基不仅能使重组菌株更好地生长，而且能使壳聚糖酶Csn21c的酶活提高128.31%，达到21.14 U/mL，是LB培养基的2.28倍（图3）。因此，确定TB培养基为壳聚糖酶Csn21c的最适发酵培养基。
图3 LB培养基、TB培养基、SOC培养基、超富培养基和ZTY培养基对pP095PCK质粒表达壳聚糖酶Csn21c的影响
Fig.3 The effect of five culture media (LB medium, TB medium, SOC medium, super-rich medium and ZTY medium) on pP095PCK-mediated chitinsanase Csn21c expression
团队简介
通
信
作
者
刘振，教授，博士研究生导师。中国海洋大学“青年英才”第一层次，第三届“香江学者”。主持国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项、国家自然科学基金面上项目及多项省部级项目,在Biotechnology Advances，Green Chemistry，JAFC，Trends in Food Science and Technology等期刊发表论文40余篇，申请专利10余项。研究方向为海洋食品合成生物学，包括海洋生物资源改性修饰与海洋功效因子从头合成。
第
一
作
者
韩瑞，中国海洋大学食品科学与工程学院2021级硕士研究生，食品科学与工程专业。研究方向：海洋食品生物技术。
引用格式
韩瑞, 初文琴, 刘振. 枯草芽孢杆菌高效分泌表达盒的构建和应用[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(11): 9-17.
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图文供稿| 作 者
编辑排版| 郑 越
内容审核| 陈雅薇
