论文荐读|南昌大学熊涛课题组：红酸汤源植物乳杆菌NCU001929的高密度培养条件研究

作者：周宁萍，蒋雪，裴琪，熊涛，刘长根*

单位：南昌大学，食品科学与资源挖掘全国重点实验室，江西南大国创院食品科技有限公司，食品学院，江西 南昌，330031

基金项目：江西省重点研发计划（20232BBF60024）；江西省农业关键核心技术攻关课题（JXNK202303-05）；江西省蔬菜产业技术体系岗位专家项目（JXARS-06）；“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“岭南特色水果功能性研究及加工技术集成与示范”（2023SDZG04）

植物乳杆菌（Lactobacilus plantarum NCU001929）是从传统自然发酵的红酸汤中分离得到的一株红酸汤发酵专用菌株，将其制备成直投式发酵剂应用于红酸汤强化发酵，有望提升红酸汤的发酵品质、缩短其发酵周期。本研究通过单因素试验、响应面试验、静态培养、发酵罐工艺优化L. plantarum NCU001929的培养基成分及最适培养条件，以期为L. plantarum NCU00192菌剂的制备提供依据。

碳源是微生物所需的主要营养物质之一，对微生物碳骨架的合成及生长代谢有着重要作用。由图1可知，初始MRS培养基的活菌数为1.33×10⁹ CFU/mL，且不同碳源对乳酸菌的生长有显著不同，麦芽糖对L. plantarum NCU001929的促生长作用最明显，其次是蔗糖和麦芽糊精。对麦芽糖浓度进一步进行优化，结果如图2所示，当麦芽糖添加量为30 g/L时，活菌数最高，达到了3.27×10⁹ CFU/mL，是初始MRS培养基的2.46倍，活菌数显著提高（P＜0.05），因此选择30 g/L的麦芽糖碳源进行后续实验。

图1 不同碳源种类对L. plantarum NCU001929的影响

图2 麦芽糖浓度对L. plantarum NCU001929的影响

氮源能为细菌提供丰富的氨基酸、矿物质、维生素等，对菌体的生长具有促进作用。基于上一步碳源优化结果，进行氮源优化。由图3可知，牛肉浸粉、细菌学蛋白胨、酵母提取粉和胰蛋白胨4种氮源对菌体的促生长有明显作用，但无显著差异。考虑胰蛋白胨的成本较高 ，最终选择牛肉浸粉、细菌学蛋白胨、酵母提取粉进行复配正交试验，3种氮源对L. plantarum NCU001929生长影响的大小关系为：酵母提取粉＞细菌学蛋白胨＞牛肉浸粉；最后的得出最优氮源复配组合，即15 g/L酵母提取粉，10 g/L细菌学蛋白胨和15 g/L牛肉浸粉。

图3 不同氮源对L. plantarum NCU001929活菌数的影响

微量元素对于微生物的发育和繁衍至关重要，它们既能够作为酶的辅因子促进酶的催化，也能够为菌体提供有效的生物活性物质。基于上述氮源优化结果，研究不同微量元素对L. plantarum NCU001929生长的影响，结果如图4所示，结果表明MnSO₄·H₂O质量浓度为0.06 mg/L时，活菌数最高，为4.85×10⁹ CFU/mL，是氮源优化结果的1.05倍，较上一步实验活菌数提高效果不显著（P＜0.05），选择该浓度为微量元素的最佳浓度。

a-FeSO₄·7H₂O添加量；b-CuSO₄·5H₂O添加量；c-ZnSO₄·5H₂O添加量；d-MgSO₄·7H₂O添加量；e-MnSO₄·H₂O添加量

图4 不同微量元素对L. plantarum NCU001929活菌数的影响

图5 不同生长因子对L. plantarum NCU001929活菌数的影响

图6 维生素C浓度对L. plantarum NCU001929的影响

通过Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验的结果选取麦芽糖、牛肉浸粉、酵母提取粉和柠檬酸三铵4个因素，通过Box-Behnken实验获得这四个因素的最佳水平以及这些因素之间的相互作用，并进一步绘制等高线图及响应面图，从而探究这些因素对L. plantarum NCU001929生长的影响。根据Design Expert得到的回归分析结果，软件预测的显著因素的最优解组合为：麦芽糖34.36g/L、牛肉浸粉17.40 g/L，酵母提取粉1.862 g/L，柠檬酸三铵2.80 g/L，对应的最大响应值为5.81×10⁹ CFU/mL。对最优解组合进行验证实验，经验证，活菌数达到5.80×10⁹ CFU/mL，与模型预测值的拟合率为99.83%，说明该模型能较好预测L. plantarum NCU001929活菌数的影响，此时，活菌数是单因素试验结果的1.12倍。

图7 因素交互作用响应面图及相应的等高线图

初始pH、温度和接菌量对活菌数都有一定的影响。合适的pH有利于保持微生物细胞膜的完整性，过酸或过碱对乳酸菌生长产生不利影响。在响应面实验优化的基础上进行静态培养条件优化，静态培养单因素试验结果如图8-A所示，当接种量为2%（体积分数）时，活菌数最高。pH单因素试验结果如图8-B所示，活菌数呈现先上升后下降的趋势，培养基的初始pH为7时活菌数最高。温度单因素试验结果如图8-C所示，最终活菌数呈现先上升后下降的趋势，培养基的初始温度为30 ℃时活菌数最高。综上，当接种量2%，pH 7，温度30 ℃，静态培养条件最佳，此时活菌数为6.40×10⁹ CFU/mL，是响应面实验结果的1.10倍。

A-接种量对活菌数的影响；B-pH对活菌数的影响；C-温度对活菌数的影响

图8 不同静态培养条件对植物乳杆菌NCU001929活菌数的影响

在静态培养优化的基础上，对植物乳杆菌 NCU001929进行发酵罐放大培养，通过改变转速，气体环境和挑选合适的中和剂控制pH等对L. plantarum NCU001929的培养进行进一步优化。发酵罐工艺优化结果见图9。选择发酵罐转速为150 r/min，最佳气体为无菌空气，发酵罐恒pH值为7.0，以25%的氢氧化钠作为中和剂，在此条件下工艺参数最佳，活菌数可达到1.32×10¹⁰ CFU/mL，是静态培养实验结果的2.06倍。

A-转速对活菌数的影响；B-气体环境对活菌数的影响；C-pH对活菌数的影响；D-中和剂种类对活菌数的影响

图9 不同发酵罐工艺条件对植物乳杆菌 NCU001929活菌数的影响

本研究通过对植物乳杆菌 NCU001929的高密度发酵配方及发酵工艺条件进行了优化。根据实验结果，最佳的培养基成分为麦芽糖34.35 g/L、牛肉浸粉17.40 g/L，酵母提取粉18.62 g/L，柠檬酸三铵2.80 g/L，细菌学蛋白胨10.00 g/L，MnSO₄·H₂O 0.06 g/L，无水乙酸钠3.00 g/L，维生素C 0.02 g/L，吐温-80 1 mL/L，磷酸氢二钾2.00 g/L；静态培养最佳条件为接种量2%（体积分数），pH 7，温度30 ℃，此时活菌数为6.40×10⁹ CFU/mL，是MRS培养基的4.81倍；发酵罐最佳工艺条件为转速150 r/min，通入无菌空气，维持发酵罐pH值为7.0，以25%的氢氧化钠作为中和剂，活菌数可达到1.32×10¹⁰ CFU/mL；是MRS培养基的9.92倍。

熊涛教授主持完成了国家863计划重点专题项目、国家自然科学基金等国家或省部级科研攻关课题29项，科研经费超3000万元。获国家科技进步奖1项、国家级教学成果二等奖1项、江西省技术发明一等奖1项、中国侨界贡献奖（创新成果）1项、中国产学研创新合作成果一等奖1项、江西省科技进步三等奖2项。获得国家发明专利8项、实用新型专利1项；根据科学发现先后在国内外核心期刊上发表学术论文84余篇，其中SCI收录16篇；取得的科研成果先后在汇源集团、北京三元、蜡笔小新、江中集团、煌上煌集团、阳光乳业集团等公司成功转化，其生产的“三元”和“阳光”牌系列益生菌发酵果蔬奶、“汇源”、“江中”、“蜡笔小新”系列益生菌发酵果蔬饮料、“蜡笔小新”牌系列益生菌发酵果汁果冻和果蔬泥、 “煌上煌”牌系列益生菌发酵蔬菜等已逐步成为省优国优的名牌产品。为我国食品工业发展、精准扶贫和乡村振兴做出突出贡献。