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一种高耐热乳糖酶的异源表达、固定化及酶学性质研究
作者：徐惠东，尤扬，游颖欣，王周平，夏雨*
单位：江南大学 食品学院
基金项目：国家重点研发计划项目“政府间国际科技创新合作”重点专项（2021YFE0101800）；江苏省重点研发计划（现代农业）项目（BE2022324）
摘要及关键词
摘要：乳糖酶在乳制品生产中具有重要作用，但是目前商用的乳糖酶耐热性低，可重复利用率差。为了解决以上问题，该实验用枯草芽孢杆菌WB800异源表达了激烈热球菌（Pyrococcus furiosus）来源的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，BgaS）。该酶最适温度为90 ℃，最适pH值为7，具有良好的应用潜力。为了提高该乳糖酶的重复利用率，该实验用壳聚糖微球为载体，采用交联法实现了BgaS的固定化并对交联条件进行优化，确定最适交联条件为：戊二醛26.50 g/L，交联温度35 ℃，交联时间2.5 h，酶添加量5.94 U/mL，优化后酶活回收率达55.11%。固定化酶相较游离酶，最适pH与最适温度相同，且在非最适pH条件下，固定化酶的相对酶活较游离酶普遍提升了18.23%以上，并且固定化酶在95 ℃条件下孵育90 min仍保有80%以上的相对活性，较游离酶提升了11.31%。并且固定化酶回收利用率高，操作稳定性好，最适条件下处理3 h即可使牛乳中乳糖含量降低至0.5%以下，达到无乳糖水平，为工业化应用提供了技术支撑。
关键词：耐热乳糖酶；壳聚糖；固定化；脱乳糖产品；枯草芽孢杆菌
主要结论
为了实现BgaS在枯草芽孢杆菌中的异源表达，本实验构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pMA0911.1-bgaS。其构建过程如图1所示，首先通过PCR扩增的方法从载体pET24a-bgaS中得到C端带有6×His-tag的编码耐热乳糖酶BgaS的基因，并引入两端新的酶切位点。随后通过限制性位点插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pMA0911.1的EcoRⅠ-BamHⅠ之间，成功构建pMA0911.1-bgaS。
图1 重组质粒构建示意图
使用EcoR Ⅰ-BamH Ⅰ对重组质粒进行双酶切并进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图2所示，酶切得到的两条条带分别在1551 bp和5285 bp左右，双酶切后获得的两个条带大小分别符合载体质粒pMA0911.1和基因bgaS的预期大小。测序结果也与预期结果一致，证明重组质粒构建成功。
左：质粒pMA0911.1-bgaS的双酶切验证（EcoR Ⅰ-BamH Ⅰ）；右：marker
图2 琼脂糖凝胶电泳验证图
通过图3的SDS-PAGE电泳结果分析，明确看到重组枯草芽孢杆菌WB800（pMA0911.1-bgaS）的破胞上清液和纯化液在60 kDa左右有明显条带，与目的蛋白的分子质量大小一致，尽管空白对照在该位置也有类似条带，但是明显可以看到重组枯草芽孢杆菌WB800（pMA0911.1-bgaS）的破胞上清液更加明显，因此证明耐热乳糖酶BgaS成功在枯草芽孢杆菌内实现可溶性表达。L5为粗酶液经过镍柱纯化后的BgaS，可以看到与L2对应位置相同且与理论大小一致，测得蛋白质量浓度为0.75 mg/mL，酶活为5.94 U/mL。纯化后的纯酶液将用作后续的固定化。
泳道L1、L2分别为重组枯草芽孢杆菌WB800 (pMA0911.1-bgaS)的破胞沉淀和破胞上清液；泳道L3、L4分别为枯草芽孢杆菌空白对照的破胞沉淀和破胞上清液；泳道L5为镍柱纯化后的纯酶液，目的蛋白分子质量均约为60 kDa
图3 重组枯草芽孢杆菌WB800的SDS-PAGE电泳图
为了提高BgaS酶的重复利用率，研究采用了壳聚糖微球作为载体，不同浓度的壳聚糖对材料的成球效果影响不同，根据表1可以看到，当壳聚糖浓度过低的时候，材料无法成球。而当壳聚糖质量浓度升高到0.04 g/mL的时候，成球效果最好。综合考虑，确定壳聚糖质量浓度为0.04 g/mL。
图4 壳聚糖浓度对成球效果的影响
通过交联法实现了BgaS的固定化。通过优化交联条件，包括戊二醛浓度、交联温度、交联时间和酶添加量，最终确定了最适的固定化条件为戊二醛浓度26.50g/L、交联温度35℃、交联时间2.5h、酶添加量5.94U/mL。在此条件下，固定化酶的酶活回收率达到了55.11%。
a-戊二醛浓度对交联效果的影响；b-交联温度对交联效果的影响；c-交联时间对交联效果的影响；d-酶添加量对交联效果的影响
图5 不同交联条件对交联效果的影响
a-pH对相对酶活的影响；b-温度对相对酶活的影响
图6 pH及温度对相对酶活性的影响
a-110 ℃; b-95 ℃; c-80 ℃; d-65 ℃
图7 游离酶及固定化酶的耐热性测试
固定化后的BgaS酶具有与游离酶相同的最适pH（7）和最适温度（90℃）。在非最适pH条件下，固定化酶的相对酶活较游离酶普遍提升了18.23%以上。此外，固定化酶在95℃条件下孵育90min仍保有80%以上的相对活性，较游离酶提升了11.31%。固定化酶还具有良好的重复使用能力和机械操作稳定性。
图8 固定化酶回收利用率
最适条件下，固定化酶能够在3h内使牛乳中的乳糖含量降低至0.5%以下，达到无乳糖水平，最大水解率为92.88%。这一结果充分说明了固定化乳糖酶在工业化生产脱乳糖产品中的巨大潜力。
本实验实现了BgaS在枯草芽孢杆菌中的异源表达，确保了酶生产来源的安全性，同时使用壳聚糖微球作载体对BgaS固定化以后进一步提高了其在脱乳糖产品生产领域的应用前景。而且相较于游离酶，固定化酶有更好的耐热性和pH稳定性。同时固定化酶具有更好的底物亲和性，在最适条件下3 h内即可实现了生牛乳的乳糖降解达到无乳糖宣称，最大水解率为92.88%。固定化酶有效实现了乳糖酶的循环利用，降低了反应成本，实现了更为安全的生产，为耐高温乳糖酶在乳制品中的应用拓展了可能。
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引用格式
徐惠东,尤扬,游颖欣,等.一种高耐热乳糖酶的异源表达、固定化及酶学性质研究[J/OL].食品与发酵工业.https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.037932.
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图文供稿| 作 者
编辑排版| 严浩东
内容审核| 董 玲
