论文荐读
重组地衣芽孢杆菌全细胞转化法制备D-阿洛酮糖
作者：魏雨1,2，李由然1,2，石贵阳1,2*
单位：
1．江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心
2．江南大学 生物工程学院
基金项目：
国家重点研发计划项目（2020YFA0907704）；国家自然科学基金项目（32172174）
摘要及关键词
摘要：该研究首次在地衣芽孢杆菌中异源表达溶纤瘤胃杆菌H10来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase，DPE），开拓D-阿洛酮糖生物合成法又一新的表达载体途径。首先，选取不同启动子介导表达该酶，选取表达效果最好的重组菌BL1进行全细胞转化条件和发酵条件的优化。利用优化后的重组菌全细胞转化条件，65 ℃、反应体系细胞OD600值为2、反应10 min、底物D-果糖100 g/L，探索出发酵培养条件，碳源为蔗糖75 g/L、初始pH 7.5、37 ℃，最终利用全细胞转化方法，65 ℃、500 g/L D-果糖、反应体系细胞OD600值为30、反应20 min，转化率达30.3%，D-阿洛酮糖产量可达120 g/L，单位酶活力达到33.3 U/mL。采用分4次添加与果糖摩尔质量比为0.4的硼酸至反应体系中的方法，将转化率提高至69.8%。该研究为工业生产D-阿洛酮糖提供一定的参考价值。
关键词：D-阿洛酮糖；地衣芽孢杆菌；全细胞转化；D-阿洛酮糖3-差向异构酶；异源表达；启动子
主要结论
本研究成功构建了pHY-P1-p2/PmtlA/P1+p2-DPE重组质粒，使得D-阿洛酮糖3-差向异构酶在地衣芽孢杆菌中成功实现异源表达。对全细胞反应条件进行探究，利用优化后的全细胞转化条件：65 ℃、反应体系细胞OD600值为2、100 g/L D-果糖、反应10 min，作为酶活检测方法中的全细胞转化条件，探究出最优发酵条件：蔗糖75 g/L、初始pH 7.5以及发酵培养温度为37 ℃。接下来，利用最优发酵条件下的菌体细胞，使用质量浓度为500 g/L的D-果糖，控制细胞OD600值为30，65 ℃反应20 min条件下，转化率达30.3%、产出D-阿洛酮糖120 g/L，单位酶活达33.3 U/mL。此前有人曾在大肠杆菌表达系统、酵母表达系统以及枯草芽孢杆菌表达系统中表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶。其中，袁堂国等利用大肠杆菌表达系统，使用700 g/L D-果糖、60 ℃、添加2.4 g/L的干重细胞、反应60 min，转化率达33%，产出D-阿洛酮糖231 g/L；胡梦莹利用枯草芽孢杆菌表达系统表达DPE，利用D-果糖浓度为45%（质量分数），反应温度55 ℃，加酶量30 U/g，D-阿洛酮糖的转化率为28.45%，反应需要8 h才能达到平衡状态；朱星星利用10 g/L马克斯克鲁维酵母工程菌在55 ℃、pH 8.0条件下，可催化750 g/L D-果糖产生190 g/L D-阿洛酮糖，转化率仅为25.33%。此外，本文将与D-果糖摩尔质量比为0.4的硼酸分4次加入到反应体系中，使D-阿洛酮糖转化率提高至69.8%，是目前报道的摇瓶培养合成D-阿洛酮糖的最高水平。
图1 生物法合成D-阿洛酮糖的工艺流程
Fig. 1 Technological process of biological synthesis of D-allulose
图2 重组质粒构建图谱
Fig. 2 Construction map of plasmid
图3 不同菌株全细胞转化产D-阿洛酮糖浓度及转化率
Fig. 3 Concentration and conversion rate of D-allulose produced by whole-cell transformation of different strains
a-温度;b-D-果糖质量浓度;c-D-果糖质量浓度;d-反应体系细胞OD600、反应时间
图4 不同全细胞转化条件对D-阿洛酮糖转化率的影响
Fig. 4 Effect of different whole-cell transformation conditions on the conversion rate of D-allulose
a-不同碳源种类(OD600值);b-不同碳源种类(酶活性);c-不同碳源浓度(OD600值);d-不同碳源浓度(酶活性);e-不同初始pH(OD600值);f-不同初始 pH(酶活性);g-不同发酵温度(OD600值);h-不同发酵温度(酶活性)
图5 不同发酵条件对D-阿洛酮糖酶活及菌体量的影响
Fig. 5 Effects of different fermentation conditions on D-allulose activity and bacterial biomass
图6 摇瓶最优发酵条件下不同加酶量与反应时间对D-阿洛酮糖转化率的影响
Fig. 6 Effect of different enzyme dosage and reaction time on the conversion rate of D-allulose under the optimal fermentation conditions in shake flask
a-硼酸添加量;b-硼酸添加次数
图7 硼酸的添加对D-阿洛酮糖转化率的影响
Fig. 7 The effect of boric acid addition on the conversion rate of D-allulose
团队简介
江南大学生物工程学院微生物发酵过程工程团队
团队多年来一直致力于安全型合成生物底盘细胞（地衣芽孢杆菌、酿酒酵母）；大宗发酵产品原料精细化处理技术以及发酵过程多参数在线检测和智能模拟技术的研究。在应用基础研究方面包括：（1）构建了糖代谢氧化还原平衡且阻断了甘油合成的酒精酵母细胞；（2）解析了地衣芽孢杆菌对碳源选择性利用的分子机制。在工程化研究方面包括：（1）建立重大淀粉酶品的绿色制造技术。（2）围绕D-阿洛酮糖发酵开发菌丝体适度分散技术与装备，集成细胞循环培养和分割发酵实现了生产过程的连续化，将D-阿洛酮糖发酵的产物浓度、发酵周期、平均糖转化率提升至世界领先水平。
近年来，在国内外学术期刊发表论文100余篇；授权专利90余项，主持国家和省部级项目15余项。除此之外，已服务企业20余家，涵盖酒精、D-阿洛酮糖、酶制剂、生物制药等行业，且10多项技术已进入中试或产业化阶段。
通
信
作
者
石贵阳，江南大学，生物工程学院/粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，教授，博士生导师。2006年起任江南大学生物工程学院教授及微生物发酵过程工程团队负责人。主要研究方向为基于合成生物学理性设计与充分挖掘微生物细胞工厂规模化生产大宗化学品的能力。作为项目负责人承担包括863重点项目、科技支撑计划等在内的国家和部省级项目10项。以通讯作者在合成生物学与工业微生物领域权威期刊Metab. Eng.等发表SCI论文73篇；获授权发明专利42项，其中国际专利4项。获包括国家技术发明奖二等奖在内的科技奖项5项。
引用格式
魏雨, 李由然, 石贵阳. 重组地衣芽孢杆菌全细胞转化法制备D-阿洛酮糖[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(16): 1-9.
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图文供稿| 作 者
编辑排版| 高春雨
内容审核| 陈雅薇
