论文荐读
人工蛋白XXA促进人源肿瘤抑素Tumstatin可溶性表达
作者：敖龙1，朱玲玉1，庞欣1，辛瑜1，郭忠鹏1，朱瑞1，李默影1，顾正华1，郭自涛2*，张梁1*
单位：
1．江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心
2．江苏大学 食品与生物工程学院
基金项目：
国家重点研发计划项目（2021YFC2100300）
摘要及关键词
摘要：为实现人源肿瘤抑素Tumstatin在大肠杆菌中的可溶性表达，构建了5种不同促溶性融合标签与tumstatin基因融合表达的重组大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）BL21（DE3），利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导重组菌进行摇瓶发酵，利用SDS-PAGE和Western-Blot分析并筛选出能可溶性表达Tumstatin蛋白的重组菌。构建的重组菌中E. coli BL21/pGEX-6p-1-Tum（含谷胱甘肽巯基转移酶标签—GST标签）、E. coli BL21/pET28a-MBP-Tum（含麦芽糖结合蛋白标签—MBP标签）、E. coli BL21/pET28a-Tum（无标签）都是以包涵体的形式表达融合蛋白Tumstatin，只有重组菌E. coli BL21/pET28a-XXA-Tum（含抗冻蛋白的反向蛋白—XXA标签）能以可溶性的形式表达融合蛋白且目的蛋白占菌体总蛋白45%以上。利用亲和层析对目的蛋白进行纯化并进行Western-Blot分析，得到分子质量为50.9 kDa的目的条带，与理论分子质量一致。进一步对重组菌BL21/pET28a-XXA-Tum的诱导剂添加浓度、诱导剂添加时间、诱导温度、诱导时间诱导条件进行优化。最终选择Tumstatin融合蛋白诱导条件为：诱导剂浓度0.1 mmol/L、2 h添加诱导剂、诱导温度16 ℃、诱导时间36 h。人源肿瘤抑素在大肠杆菌中可溶性表达为大量制备可溶性人源肿瘤抑素奠定了基础，可为功能性多肽在大肠杆菌中的可溶性表达提供借鉴。
关键词：人源肿瘤抑素；大肠杆菌；可溶性表达；融合标签；抗冻蛋白的反向蛋白
主要结论
1．在本研究中，我们首先探究了不同促溶标签与人源肿瘤抑素基因tumstatin在大肠杆菌中的融合表达以及tumstatin基因单独表达情况。由图1-f可知，tumstatin基因在大肠杆菌中单独表达时，Tumstatin蛋白是以不溶性的包涵体形式产生。然而不同促溶标签对Tumstatin蛋白的可溶性表达有不同程度的影响。谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-transferase，GST）标签（图1-b）、麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）标签（图1-d）对Tumstatin的可溶性表达没有促进作用，仍然是以包涵体的形式表达；而当小分子泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）标签与NusA蛋白（N-utilization substance A）标签与tumstatin基因融合表达时，Tumstatin蛋白不表达（图1-c、图1-e）；但是，我们发现抗冻蛋白的反向蛋白—人工XXA蛋白标签能够显著提高Tumstatin蛋白的可溶性（图1-a），通过对条带进行灰度扫描，发现目的蛋白占总蛋白45%以上，是目前在大肠杆菌中可溶性表达效果最好的。
图1 各重组菌融合蛋白表达情况
Fig.1 Expression of each recombinant bacterial fusion protein
2．进一步对目的蛋白进行纯化和Western-Blot分析发现，我们成功表明成功构建了能高效可溶性表达融合蛋白XXA-Tumstatin的重组菌E. coli BL21/pET28a-XXA-Tum。
图2 蛋白纯化及western-blot结果
Fig.2 Protein purification and Western-Blot results
3．最后，对重组菌E. coli BL21/pET28a-XXA-Tum的诱导条件进行优化。首先研究了诱导剂浓度对重组菌蛋白表达和生长的影响，随着诱导剂IPTG浓度的升高，菌体生长受影响，目的蛋白的表达也受到影响。从结果来看，添加终浓度0.1 mmol/L的IPTG时OD600最高为14.4，蛋白浓度达到1.01 mg/mL，并且考虑到过高浓度IPTG会抑制菌体生长进而影响蛋白表达，因此选择0.1 mmol/L的IPTG为最适浓度；其次，我们发现诱导剂添加过早或者过晚都会影响菌株的生长和代谢，2 h添加诱导剂时重组菌生长和蛋白表达都为最优，OD600和蛋白浓度分别达到16.0和0.92 mg/mL，因此选择2 h添加诱导剂；进一步，随着温度的升高，重组菌的生长呈现降低的趋势，蛋白表达也逐渐降低。16℃诱导时，菌蛋白表达最高为1.06 mg/mL，其余三个温度诱导蛋白表达无明显差异，选择16℃为最优诱导温度；最后，我们还探究了诱导时间对重组菌蛋白表达的影响，随着诱导时间的延长，菌体量与蛋白表达量都逐渐增多，诱导时间达36 h时，菌体OD600和蛋白浓度分别为19.8和1.09 mg/mL。诱导时间太长会导致培养基不足，细胞不能完成正常代谢，结合周期和成本问题，选择诱导时间为36 h。通过对重组菌进行条件优化后，筛选出该重组菌最佳的诱导条件为：IPTG浓度0.1 mmol/L、2 h添加诱导剂、诱导温度16℃、诱导时间36 h，目的蛋白最高能达到1 mg/mL左右，是目前Tumstatin异源表达的最高产量。
图3 发酵条件优化
Fig.3 The optimization of fermentation process
注：大写字母表示OD600的显著性统计, 小写字母表示蛋白浓度的显著性统计，不同字母代表组间具有显著性差异（P<0.05）。
本研究对微生物生产可溶性人源功能性蛋白或多肽有一定借鉴作用，也为大量获取可溶性Tumstatin蛋白及研究Tumstatin蛋白在肿瘤治疗中的作用奠定基础，后续实验将纯化Tumstatin蛋白并进行细胞实验验证其功能活性。
团队简介
本团队主要从事活性生物制造、环境生物修复、发酵过程工程相关领域的应用基础研究及应用技术开发等工作，包含全领域工业酶制剂的创制、新型底盘细胞工厂的构建、生物工程智能装备的研发、微生态制剂的开发与应用、功能性原料的挖掘与制备等。
通
信
作
者
张梁，江南大学校长助理，教授，博士生导师。长期从事医药与食品工业酶制剂的开发与制备、生物资源高值化利用等相关领域的应用基础研究及应用技术开发。主持承担了国家自然科学基金、国家“863”计划目标导向课题、国家重点研发计划项目等国家级课题7项、军科委“166工程”项目、江苏省工业前瞻性项目等省部级课题10余项。发表SCI论文70余篇；申请国家发明专利70余项，其中已获授权37项；申请国际专利8项，其中已获美国、欧洲等专利授权4项；参编“十一五”、“十二五”国家规划教材2部；荣获省部级科技奖励3项。
引用格式
敖龙, 朱玲玉, 庞欣, 等. 人工蛋白XXA促进人源肿瘤抑素Tumstatin可溶性表达[J].食品与发酵工业, 2024, 50(12): 1-8.
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图文供稿| 作 者
编辑排版| 郑 越
内容审核| 陈雅薇
