封面文章
枯草芽孢杆菌无细胞上清液抑制单增李斯特菌生物被膜形成的研究
作者：胡安祺1，杨慧轩1，姚现琦1，董鹏程1，朱立贤1，罗欣1,2,3，张一敏1,2*，刘昀阁1*
单位：
1．山东农业大学 食品科学与工程学院
2．国家牛肉加工技术研发专业中心
3．江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心
基金项目：
国家重点研发政府间国际科技创新合作专项（2019YFE0103800）；山东省自然科学基金（ZR2022QC182）；现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-37）
摘要及关键词
摘要：单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，其生物被膜是导致食品污染和疾病传播的重要原因。该研究选用枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）无细胞上清液（cell free supernatant，CFS）作为抑制剂，探究B. subtilis CFS在抑制L. monocytogenes野生菌株118（以下简称No.118）生物被膜方面的作用和潜力。首先测定了B. subtilis CFS的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），接着采用结晶紫染色法测定了不同亚最小抑菌浓度下Bacillus subtilis CFS对No.118的生物被膜抑制率，发现不同亚抑菌浓度下的CFS对No.118生物被膜均具有显著的抑制作用，且在1/64 MIC时生物被膜抑制率仍可达到47%；同时Bacillus subtilis CFS对No.118生物被膜代谢活性、自聚集率、表面疏水性、群集泳动能力和膜外聚合物分泌也均有显著抑制作用；最后，通过激光共聚焦显微镜观察了在CFS作用下，No.118生物被膜结构和细胞分布的变化规律，经CFS处理后，No.118生物被膜结构松散，细菌数量明显减少。综上，Bacillus subtilis CFS可通过影响No.118生物被膜细胞的代谢活性、自聚集能力和群集泳动能力以及膜外聚合物的分泌来抑制其生物被膜形成，对探究益生菌代谢产物作为生物被膜抑制剂方面的应用具有重要的参考价值。
关键词：枯草芽孢杆菌；无细胞上清液；单增李斯特菌；生物被膜；激光共聚焦显微镜
主要结论
枯草芽孢杆菌CFS对No.118生物被膜具有显著的抑制作用，MIC下生物被膜抑制率可达69%，在浓度为1/16 MIC到1/64 MIC之间的抑制率趋于稳定，并保持47%左右。
同时，枯草芽孢杆菌CFS对No.118生物被膜中细胞代谢活性具有显著的抑制作用，MIC下抑制率最高为35%，随着稀释倍数的增加，抑菌浓度降低，抑制作用也显著降低，且在1/64 MIC时，CFS仅有14%的代谢活性抑制率。枯草芽孢杆菌CFS对No.118的细胞自聚集具有显著抑制作用，最高可在65%左右，在亚抑菌浓度1/2 MIC-1/4 MIC处仍有50%以上的抑制作用，之后随抑制浓度的降低，抑制率随之降低。枯草芽孢杆菌CFS对No.118具有很强的表面疏水抑制作用，其中枯草芽孢杆菌CFS抑制浓度在MIC-1/64 MIC之间时，枯草芽孢杆菌CFS对No.118的抑制率维持在75%以上。枯草芽孢杆菌CFS对No.118的单一泳动能力具有轻微的促进作用，不表现为显著抑制作用，而在群集泳动能力的上表现出浓度依赖的抑制差异枯，说明草芽孢杆菌CFS更多表现为对No.118的群集泳动能力的抑制，从而影响生物被膜的形成。
最后的激光共聚焦结果表明：与对照组相比，经CFS处理的No.118生物被膜细胞大量受损，SYTOX荧光染料大量穿透受损的细胞膜并在图中广泛显示呈绿色，并且具有完整细胞膜结构的生物被膜细胞（蓝色荧光）数量明显低于对照组，该结果验证了本研究中生物被膜抑制率结果的同时，更加直观的观测了No.118在不同浓度枯草芽孢杆菌CFS处理下生物被膜的结构特点。
图5 CFS对No.118生物被膜结构的影响
Fig.5 Effect of CFS on the structure of No.118 biofilm
注：A，a分别为CLSM下观察的No.118的2D和3D结构图；1为对照组；2、3、4、5、6分别为MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC浓度CFS处理下No.118生物被膜结构图。
本研究发现枯草芽孢杆菌CFS可作为一种天然抑菌剂抑制L. monocytogenes生物被膜形成。枯草芽孢杆菌CFS显著降低了生物被膜内的细胞代谢活性，这很可能影响了No.118的生物被膜形成相关代谢通路，使得细菌对营养物质的分解效率减慢，降低了细胞的初始黏附能力，并最终影响生物被膜的形成。而细胞的表面疏水能力与细胞膜上的疏水基团有关。由此推测，枯草芽孢杆菌CFS中含有的肽类抑菌物质的疏水基团与No.118细胞膜成分中的疏水基团相互作用，使其极性降低，表现出疏水抑制。此外，细胞的自聚集能力与鞭毛的群集泳动能力有关，属于生物被膜形成初始阶段的细胞互作。本研究中的抑制机制可能涉及相关的群体感应调控，细胞的单一泳动没有被抑制也证明了这一点。并且，类似的研究也表明，细菌素可作为一种群体感应抑制剂，通过下调群体感应基因以及干扰信号分子交流来控制L. monocytogenes生物被膜的形成。
因此，本研究中枯草芽孢杆菌CFS是否基于对L. monocytogenes生物被膜群体感应信号分子的作用机制可作为进一步研究的重点。
团队简介
动物源性食品加工与安全控制研究团队
动物源性食品加工与安全控制研究团队依托于国家牛肉加工技术研发专业中心、山东省畜禽食品品质安全控制与智慧制造国际联合实验室、国家肉牛牦牛产业技术体系加工与质量控制研究室、山东省牛产业技术体系和山东省生猪产业技术体系等平台，紧跟国际肉品科学前沿，从事畜产加工与安全控制研究已有三十多年时间，正逐步打造成为中国的“牛肉研究中心”。
团队多年来致力于从畜禽宰前-宰中-宰后多个关键生产环节，开展牛肉、猪肉等畜禽及其制品的现代化生产与质量安全关键控制技术研究。近年来注重食品无损检测、物联网等智慧制造手段的研发，将无损检测、物联网、人工智能等技术无感地嵌入食品生产的全链条，进行信息感知，引领产业发展，联合复旦大学、浙江大学、中国农业大学、南京农业大学、四川大学等高校共同进行“国家重点研发计划政府间国际科技创新合作旗舰项目”的研发，研究成果“中欧食品安全智慧管理平台”推动了推动“互联网+”、“过程控制”理念等与食品安全控制的深度融合,提升我国畜禽食品安全水平，打破中欧国际合作贸易壁垒。相关核心技术已在山东、内蒙古、宁夏、重庆等多家企业得到应用推广，其中6家企业近三年新增利润5.66亿元，新增税收13230.16万元，节支总额395.28万元。对我国牛肉及牛肉制品质量和安全水平的提高起到了重大推动作用，提高了我国牛肉生产及加工行业的国际竞争力，同时产生了可观的社会效益。
通
信
作
者
张一敏，女，教授、博士生导师，工学博士，生物学博士后。国家肉牛牦牛产业技术体系岗位科学家、山东省高等学校优秀青年创新团队--牛肉品质控制创新团队带头人，山东农业大学“1512”工程第二层次人才，美国犹他州立大学、澳大利亚基础工业部红肉研究中心访问学者。曾任中国畜产品加工研究会副秘书长，现为理事、青年委员会委员。
引用格式
胡安祺, 杨慧轩, 姚现琦, 等. 枯草芽孢杆菌无细胞上清液抑制单增李斯特菌生物被膜形成的研究[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(13): 1-8.
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图文供稿| 作 者
编辑排版| 郑 越
内容审核| 陈雅薇
