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瘤胃微生物生态系统是动物中最复杂的肠道微生物生态系统之一。肠道微生物在维持宿主消化道的稳态、营养消化和吸收、生产性能、免疫健康和行为方面发挥着重要作用。牛羊等的反刍动物主要以膳食纤维为食，在瘤胃环境下发酵后可产生大量的SCFAs（短链脂肪酸）等酸性物质，参与多种反刍动物代谢途径。研究表明，许多细菌已被用作饲料添加剂，可以有效促进动物的生长发育，例如普米芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等。本研究采用溴甲酚绿色鉴定培养基，从牛瘤胃内容物中获取了980株具有产酸能力的细菌菌株。结合测定产酸能力和16S rRNA扩增子测序技术，筛选出5株产酸能力强的菌株，成功验证了产酸菌可以促进绵羊生长，并探讨了牛体重变化的原因。![]()
在屠宰场屠宰后立即取出瘤胃内容物，置于无菌离心管中低温保存至实验室培养产酸细菌。产酸菌分离和纯化：使用溴甲酚绿色鉴定培养基进行培养，选择产生黄色透明环的菌落进行纯化，三轮纯化后获得纯培养物。产酸菌的分子鉴定：使用16S序列扩增+PCR反应进行菌株扩增，对其进行测序分析，测序结果与NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中BLAST平台中的Blastn进行比较，并利用MEGA软件构建系统发育树。产酸能力的鉴定：产酸菌接种在溴甲酚绿色筛选培养基中，溴甲酚绿遇酸由绿变黄，据黄色区域大小和固体介质颜色深度鉴定其产酸菌株。产酸菌的发酵培养：使用TSB液体培养基通过摇动烧瓶发酵来培养获得的产酸菌株，以获得足够浓度的细菌。动物实验：将14只6月龄的雌性绵羊随机分为两组（每组各7头）。实验组每只羊给予5 mL混合细菌悬浮液，其中含有5种产酸菌，活菌数为5×10^11cfu；对照组则给予等量的 PBS。试验为期18天，每天对绵羊进行管饲。在最后一次管饲后24小时，使用体内瘤胃液体收集装置收集所有绵羊网状末端附近的瘤胃内容物，进行后续的微生物物种多样性分析。使用溴甲酚绿色鉴定培养基从固体培养基的黄色区域中共筛选出980株细菌菌株，其中编号为32、80、82、150和898的五种菌株产酸能力较强。使用BLAST平台比较了产酸细菌的全长16S rRNA序列，并将其与系统发育树相结合，我们确定菌株 32 是最接近 Bacillus pumilus 菌株 LG 135 的亲缘关系；菌株 80 与平肠球菌菌株 ZZU A2 关系最密切；菌株82与枯草芽孢杆菌菌株MK736123.1关系最密切；菌株150与屎肠球菌菌株CAU10327亲缘关系最密切；菌株898与枯草芽孢杆菌菌株SLL2亲缘关系密切。![]()
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在管饲处理的第15天，实验组的体重增加显著高于对照组。灌胃后绵羊的饲料转化率显著提高：试验组的饲料转化率为12.01%，对照组的饲料转化率为7.75%。![]()
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通过16S rRNA测序，在对物种信息进行注释后，我们选择了两个分类水平（即门和纲）的前10个丰度作为直方图。其中，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和放线菌门（Actinobacteria）在门水平上为主。与对照组相比，Firmicutes, Cyanobacteria（变形菌）和 Patescibacteria（帕特西杆菌）的丰度降低。Bacteroidetes, Proteobacteria和Actinobacteria的丰度增加。纲水平上主要有梭状芽胞杆菌（Clostridia）、拟杆菌、γ变形杆菌（Gammaproteobacteria）、糖单胞菌（Saccharimonadia）、杆菌（Bacilli）、放线菌和酸杆菌。选择丰度最高的前35个属，根据各样品的丰度信息，在物种和样品水平上对属进行聚类，并绘制热图以确定每个样品中物种的聚集含量。![]()
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箱线图分析结果显示，试验组微生物多样性指数显著高于对照组，管饲18 d后肠道菌群结构发生变化，表明两组微生物群落存在较大差异，尤其是在属水平上。通过绘制火山图，我们发现对照组和实验组有50个显著属水平差异，其中35个显著下调，15个显著上调，其中厚壁菌门在对照组中起重要作用。此外，绵羊瘤胃中p_Firmicutes的丰度降低，而p_Bacteroidota、p_Actinobacteriota、p_Acidobacteriota和p_Proteobecteria的丰度增加。本研究采用溴甲酚绿色筛选培养基分离出980株产酸菌株，测定其产酸能力，选取，包括普氏芽孢杆菌、平氏肠球菌、屎肠球菌和枯草芽孢杆菌在内的5株产酸菌，将之混合制得细菌悬浮液，各菌株浓度为10^11 cfu/mL，并对健康绵羊进行管饲处理。结果表明，混合菌可以提高绵羊日增重和饲料转化率，改变绵羊瘤胃中微生物的组成和丰度。本研究分离出的菌株是具有显著促进生长作用的常见益生菌，为进一步研究益生菌的功能奠定了基础。 鉴于混合菌的显著作用，生产实践中可以制备混合菌的干粉制剂，并用作饲料添加剂，以降低畜牧业成本，提高养殖效率。
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https://doi.org/10.7717/peerj.16294
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