074 研究快报 | 羊日粮粗蛋白质和蛋白质溶解度调控可通过肠道菌群和代谢组重组促进肠道氮吸收,减轻活性氮排放

文摘   2024-07-06 12:00   河北  


研究背景

人类食物和牲畜饲料之间的竞争愈演愈烈,开发以环境保护、资源节约和高产品质量为优先的可持续系统已成为反刍动物生产的必要前提。
然而,与单胃动物相比,反刍动物的氮利用效率较低,饮食营养控制(例如蛋白质组分)可以降低反刍动物的环境足迹(Environmental Footprints),特别是活性氮(N),这导致相对较高的氮损失和温室气体排放。
有研究发现,精准饮食干预可以通过实施低氮饮食或调整膳食蛋白质组分的比例来提高反刍动物的氮效率并降低其反应性氮排放的环境足迹。
此外,后肠氮代谢也应该被重视,有研究表明有超过15%的牛饲料氮通过粪便排入下水道,造成了很大的浪费。
因此本研究旨在调查膳食可溶性蛋白(SP)水平和粗蛋白(CP)降低对肠道氮吸收、后肠氮代谢、粪便微生物群和代谢物的影响,及其与氮代谢表型的联系。

材料与方法

试验按体重相近原则选用32只健康雄性湖羊,通过变化膳食可溶性蛋白(SP)含量来分为以下四组:
CON组:对照,基础日粮,根据国家研究委员会标准中概述的营养需求制定的。
LPA组:将SP比例调整为CP的21.2%
LPB组:将SP比例调整为CP的25.9%
LPA组:将SP比例调整为CP的29.4%
目标SP水平主要是通过调整各种精矿的添加量来实现的。4种日粮均为等能日粮,3种处理日粮均为等氮日粮,均满足CP标准要求的90%。
每天早晚两次喂食(08:00 和 18:00),以 DM 为基础的日粮饲喂水平设置为绵羊 DM 体重的 3%,日粮包括50:50的牧草与精料比例,自由饮水。
采集饲料样本进行常规营养成分分析;在试验最后三天每组随机抽取6只绵羊,在早晨喂食后4小时收集直肠粪便样品,深度冷冻保存用于后续发酵参数、粪便pH值、微生物蛋白(MCP)、短链脂肪酸(SCFA)、碳(C)和氮(包括无机氮)含量以及酶活性分析,并将最后一天收集的 5 g 粪便在液氮中快速冷冻,用于随后的 DNA 提取和代谢组学分析。
试验饲喂的最后一天将羊禁食过夜,禁食2小时后对其进行静脉注射麻醉并采集血样10mL,4℃下离心分离取血浆用于后续生化指标检测及血浆氨基酸(AA)浓度的检测。十二指肠、空肠和回肠中取组织样本,用于后续分析。
试验最后三天记录所有绵羊的采食量以确定氮摄入量,收集粪便和尿袋并用10%硫酸进行固氮,取粪便和尿液总量10%进行粪便氮和尿氮的排泄分析。

试验结果

粪便发酵指标

与CON相比,日粮处理对pH值和MCP浓度无显著影响,而所有处理组(LPA、LPB和LPC)的总SCFA浓度显著降低;与LPB和LPC相比,LPA的浓度显著降低。
此外,与CON和LPC相比,LPA中丙酸盐的比例显著降低,丁酸盐的比例显著增加。
在支链脂肪酸方面,LPA和LPB的异丁酸酯比例显著低于CON和LPC,各组戊酸盐和异戊酸盐百分比无显著差异。
粪便中氮转化的不同形式、酶活性和基因转录水平

LPB中的TN含量显著低于CON;然而,在处理之间没有观察到碳氮(C/N)比值的显著差异。
与CON相比,LPB和LPC的无机氮含量显著降低。
在酶活性方面,与CON相比,LPB显著降低了硝酸盐还原酶活性;不同处理的亚硝酸盐还原酶活性没有差异。
在基因转录水平方面,与CON相比,3种低蛋白处理(LPA、LPB和LPC)的粪便谷氨酸脱氢酶基因(gdh)基因丰度下调,其中LPB最低。
此外,与CON和LPA相比,LPB的硝酸还原酶基因(narG)基因丰度显著降低,而LPB和LPC之间没有差异。
与CON相比,LPB和LPC的亚硝酸还原酶基因(nirK)基因和一氧化氮还原酶基因(norB)基因的丰度显著降低。
粪便微生物多样性和分类学差异

4个处理共享的OTU数为1252,占总OTU数的58.5%。
LPB和LPC共享的OTU数量最多(105个,4.9%);CON、LPA、LPB和LPC的OTU数量分别为42个、42个、72个和120个(5.6%,最高)。
低蛋白处理显著提高了物种丰富度,而样本多样性(包括Shannon和Simpson)在处理中没有显著性;
β多样性结果(基于Bray-Curtis差异矩阵的PCoA)揭示了细菌群落的显着差异。
在分类方面,Firmicutes(57.1%-76.8%)、Bacteroidetes(12.4%-23.1%)和Proteobacteria(3.0%-4.3%)是前3个优势门(图2C); Ruminococcaceae(25.4%-43.8%)和Lachnospiraceae(9.4%-16.7%)是优势科(图2D),Ruminococcaceae UCG−005(10.5%至17.7%)和Christensenellaceae R−7组(8.5%至16.6%)的丰度占属水平的前2名。
粪便代谢组谱和通路富集分析

基于LC-MS/MS分析,从24个粪便样本中共鉴定出696种正离子模式代谢物和573种负离子模式代谢物。
除全局图和概览图(2级)外,通路“AA代谢”在阳性和阴性模式下均最高。

通路富集分析(图4A)显示,随着CP的降低,24条代谢通路(LPA、LPB和LPC)发生了改变。
氨基糖和核苷酸糖代谢途径(如酪氨酸代谢途径、赖氨酸降解途径、组氨酸代谢途径和苯丙氨酸代谢途径)和不饱和脂肪酸的生物合成途径在CON中富集。
随着低蛋白日粮中SP比例的增加,“丙酮酸代谢途径”、“丙酸代谢途径”、“硫胺素代谢途径”以及“苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸生物合成途径”显著增强。
Spearman等级相关性表明细菌属(丰度前 20 名)与粪便中差异代谢物之间的复杂关系。Psychrobacter(主要富集CON)与AA、肽和类似物呈负相关(图4B)。Prevotella 1(富含LPB)也表现出类似的模式,与大多数碳水化合物和碳水化合物偶联物、脂肪酸和偶联物、亚油酸和衍生物、嘧啶和嘧啶衍生物等也呈负相关。
血液常规检查和血浆生化指标

血液常规指标(白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板含量)在各组均无显著差异。
在血浆生化指标方面,低蛋白处理(LPA、LPB和LPC)显著降低了肌酐、氨和尿素氮的浓度,而其他生化指标在所有处理中均无显著差异。
肠道AA/肽转运蛋白的mRNA丰度和血浆AA浓度

与CON相比,LPA处理导致十二指肠、空肠和回肠中SLC1A1、SLC7A2、SLC7A8和PHT1的丰度显著降低。
然而,LPB和LPC处理与CON的无显著差异。
此外,在十二指肠中,LPA中SLC1A5的mRNA丰度显著低于CON的mRNA丰度;SLC7A1在LPA中的mRNA丰度显著低于CON和LPB。
三个低蛋白处理组(LPA、LPB和LPC)的PHT2的mRNA丰度均显著低于CON。
在回肠中,与CON相比,LPA处理导致PepT1的mRNA丰度显著降低。
如上图B所示,在低蛋白饮食中,当 SP 水平调整为 CP 的 25.9% (LPB) 或 29.4% (LPC) 时,精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸和鸟氨酸的浓度发生了变化。
氮吸收和氮效率
膳食CP的减少导致氮摄入量的减少,二者之间关系显著。
当SP(CP的百分比)调整为25.9(LPB)和29.4(LPC) 时,氮排泄量显著减少,氮吸收和氮效率显著增加;
与CON相比,氮效率分别提高了12.2%和8.5%。
粪便微生物群、衍生代谢物和氮代谢表型的相关性

冗余分析(RDA)显示,C/N比是影响粪便微生物群落的主要因素,其次是氨氮和亚硝酸盐氮。
几个细菌类群与C/N比呈正相关,包括OTU 892、852、1046、348、861、1315和910,它们主要属于Ruminococcaceae。
总SCFA浓度与丙酸盐呈正相关,与丁酸盐呈负相关。
丁酸盐浓度与nirK基因丰度呈负相关。
narG基因丰度与脲酶和硝酸还原酶活性呈正相关,与丙酸盐浓度呈负相关。
脲酶和硝酸盐还原酶活性与粪便微生物群相关。
在AA分类中,TN和脲酶活性与粪便差异代谢物相关;
血浆氨浓度、总SCFA含量、脲酶活性和GDH基因丰度与碳水化合物分类中的差异代谢物相关;
血浆尿素氮和氨、粪便TN、总SCFA、脲酶活性和narG基因丰度与血浆AA浓度相关。
结论:
本研究表明,将膳食 CP 含量降低约 10% 成为从源头减少氮排放的有前途的策略。
值得注意的是,在低蛋白饮食中将膳食SP水平微调至CP的25%至30%会显示出放大效应。
这种调整不仅有助于粪便脲酶活性的下降,而且还影响氨氮和亚硝酸盐氮含量下降。
肠道 AA 和肽转运蛋白的 mRNA 丰度上调,加上血浆 AA 浓度升高,表明氮效率的显著提高。因此,这种细致入微的饮食干预有望优化在牲畜上的氮高效利用。
展望:本研究结果强调了膳食SP水平与尿素氮循环之间的复杂关系。
血浆尿素循环相关 AA 与 SP 水平的变化强调了在未来需要对尿素 N 循环对膳食 SP 操作的全身反应进行全面研究。这对于促进对动物生产系统中可持续和高效氮管理战略的理解和完善至关重要。

了解更多请阅读原文献:

https://doi.org/10.1016/j.aninu.2024.04.003
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