LCMV克隆13或LCMV-D菌株感染小鼠，是T细胞耗竭第一个表征的模型，并在之后的研究中被持续使用。（Moskophidis D, Lechner F, Pircher H et al. Virus persistence in
acutely infected immunocompetent mice by exhaustion of
antiviral cytotoxic effector T cells. Nature 1993;362:758–61.）实验需要在不同时间点从感染小鼠的脾脏/淋巴结/组织中获取抗原特异性T细胞，并分析其功能和表型，需要投入大量的时间投入（约30天），且产生的细胞数量有限，另外从小鼠到人类的转化仍然是一个挑战。人类耗竭的T细胞首先是从慢性病毒感染（即HIV、HBV、HCV）患者中发现并研究的（Gerlach JT, Diepolder HM, Jung M et al. Recurrence of hepatitis
C virus after loss of virus-specific CD4+T-cell response in acute
hepatitis C. Gastroenterology 1999;117:933–41.）。大约在同一时间，从多种肿瘤（例如人转移性黑色素瘤组织、卵巢癌、非小细胞癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和慢性髓系白血病）患者中分离出并继续鉴定出耗竭的浸润性T细胞（当时定义为抑制性受体上调和体外刺激时细胞因子产生减少）（ Lee PP, Yee C, Savage PA et al. Characterization of circulating T
cells specific for tumor-associated antigens in melanoma
patients. Nat Med 1999;5:677–85.）。
| 小鼠模型 | 人体组织 |
| 分离方法 | 首先从CD45.1同源小鼠中分离出具有已知抗原特异性的T细胞，过继转移到病毒感染/肿瘤CD45.2小鼠模型中。然后从CD45.2+小鼠的脾脏/血液/血液中重新分离CD45.1+
T细胞，进行表型/功能表征。 | 从机械消化的单细胞悬液中，分离出T细胞或者已知抗原特异性T细胞（使用MHC四聚体分离，需要事先了解T细胞抗原特异性）。根据表面标记物判定细胞耗竭。 |
| 耗费时间 | 在T细胞转移到肝肿瘤小鼠模型后的30天。病毒感染的小鼠中分离Tex细胞在感染后8-30天之间进行。 | 即刻从组织中获得。 |
| 供后续实验的细胞量 | 较少，约10^6，研究者通常需要合并使用几只小鼠的细胞进行组学研究。 | 直接获取PD1+抗原特异性T细胞难度很大。故通常直接从组织解离悬液中分选特定T细胞进行单细胞研究。 |
| 可及性 | 高 | 低且不稳定。需要来自特定医疗机构，组织样本来源不稳定。 |
| 机制研究 | 可能。因为转基因T细胞可以从受感染小鼠的脾脏/组织/血液中重新分离，或者进行原位追踪。 | 非常困难/不可能，因为Tex的建立不能在人体组织外植体中原位跟踪。然而，通过将已知抗原特异性的T细胞转移到患者来源的类器官中，有可能跟踪人Tex |
| 因果关系 | 很难确定因果关系，因为解析出来自不同细胞间相互作用和微环境的许多信号是具有挑战性的。 | 不可能。对从人体组织中分离出来的Tex的分析，只能提供其状态和局部微环境影响信息 |
由于其易用性和可扩展性，使用抗CD3 / 抗CD28（包被于平板或磁珠上）持续激活T细胞，以诱导耗竭模型，现在使用越来越多。2018年塔夫斯大学医学院Balkhi等人第一次使用细胞活化磁珠在体外诱导耗竭模型。![]()
（ Balkhi MY, Wittmann G, Xiong F et al. YY1 upregulates checkpoint receptors and downregulates Type I cytokines in
exhausted, chronically stimulated human T cells. iScience 2018;
2:105–22）。用抗CD3/CD28磁珠刺激外周人CD4+和CD8+ T细胞8天，引起耗竭标志物（PD-1/LAG-3/TIM-3）表达升高，细胞因子产生减少，杀伤能力降低。该研究没有对细胞进行深度转录组，表观遗传和代谢分析，很难判断是否可以完全等同于体内细胞耗竭。且在第8天后去除磁珠，耗竭状态是否会逆转。2022年纽约大学的Corselli等人扩展了这种方法，对用抗CD3/CD28磁珠和IL-2刺激T细胞14天时发生的表面和转录变化进行了更广泛的分析。使用AbSeq跟踪38种表面蛋白表达的变化，对400个基因进行靶向RNA-seq分析![]()
（ Corselli M, Saksena S, Nakamoto M et al. Single cell multiomic
analysis of T cell exhaustion in vitro. Cytometry A 2022;101:
27–44.）。总体而言，使用抗CD3 / CD28抗体长期刺激T细胞是一种可行的，可扩展的方法，可以生产大量具有耗竭样特征的T细胞。但是这个方法本身最早用于诱导T细胞凋亡，因此需要采取适当的实验条件控制和/或方法在分析中去除凋亡细胞。为了更好地模拟生理T细胞活化，用抗原刺激OT-1特异性CD8+小鼠T细胞。他们将细胞与OVA 肽以及细胞因子（IL-7和IL-15）一起孵育5天，细胞产生IFN-γ、IL-2、TNF-a，耗竭表面标志物的表达增加，杀伤能力降低。终末耗竭T细胞典型的转录因子表达和甲基化模式，即TOX和T-bet表达增加，TCF-1下调，与甲基化增加相吻合。![]()
（Zhao M, Kiernan CH, Stairiker CJ et al. Rapid in vitro generation of bona fide exhausted CD8+T cells is accompanied by Tcf7promotor methylation. PLoS Pathog 2020;16:e1008555.）
巴塞尔大学肿瘤免疫实验室使用肿瘤细胞重复刺激健康人NY-ESO-1特异性CD8+T细胞，体外产生耗竭T细胞，PD-1表达增加、细胞因子产生减少（IFN-γ、TNF-a）、特异性杀伤减少、脱颗粒减少和增殖减少。![]()
（Trefny MP, Kirchhammer N, Auf der Maur P et al. Deletion of
SNX9 alleviates CD8 T cell exhaustion for effective cellular
cancer immunotherapy. Nat Commun 2023;14:86）。
