免疫系统是一个高度复杂、动态的细胞网络，执行无数的专业细胞功能，对宿主每个器官的健康都至关重要。
目前，我们依旧不是很清楚病理学中涉及哪些细胞亚型或分子途径，也不知道如何靶向他们。精确的解决方案首先需要精确的知识。
对免疫系统内异质性的认识始于19世纪。从那时起，由Ilya Mechnikov，Paul Ehrlich等领导的科学家开始将免疫细胞分为不同的组（基于活性，形状，大小和形态等物理特征）。现如今，我们可以最近考虑基于分子特征。到20世纪末，能够测量每个细胞上多种蛋白质表达的技术的出现，例如流式细胞术等，为此铺平了道路。
大多数单细胞RNA测序（scRNA-seq）平台共享的基本步骤包括：（1）细胞分离，（2）细胞裂解获取mRNA分子，（3）将mRNA分子转化为cDNA，同时用独特的细胞和分子条形码（UMI）对每个分子进行条形码编码，以及（4）标记分子的汇集以及下游文库构建和测序。目前，四种主要单细胞平台广泛用于免疫系统研究，每种平台都有自己的优点和缺点。第一种类型被广泛称为“微流体”技术，利用不同的乳液和微流体设置将单个细胞划分为微油滴，以及细胞条形码试剂，这些试剂将在下游分析中唯一地识别细胞和RNA分子，以及测序所需的试剂。常用平台包括Drop-seq、In-drop、例如10X Chromium平台。这些微流体装置有助于在单个实验中分析数千个细胞，使研究人员能够生成免疫细胞群的大型“地图”。第二种类型的单细胞分析平台基于分割池连接的转录组测序（SPLiT-seq），其中固定细胞或细胞核随机分布到孔中，其转录本用孔特异性条形码标记。另一种种技术是单细胞组合流体索引”（scifi）技术（sci-RNA-seq），这些技术能够以相对较低的成本生成大量组织图谱。第三种技术类型是基于条形码mRNA捕获珠与亚纳升模式孔的组合，例如Seq-Well和Microwell-seq，它们是具有成本效益的平台，可实现高通量分析。第四种技术包括使用荧光激活细胞分选（FACS）的单细胞区室，将其放入包含良好特异性逆转录（RT）条形码的96孔或384孔板中，然后对单个细胞进行标记和测序。一些主要的基于FACS的技术包括大规模并行单细胞RNA测序（MARS-seq）和SMART-seq。最近，引入了 SMART-seq3，一种大规模、灵敏的长读长覆盖方法，可实现等位基因和亚型分辨率。单细胞多组学代表了标准scRNA-seq的重大进步，通过整合不同的数据类型（如蛋白质组学或表观基因组学，以及空间或时间信息）并利用多个数据集，描绘了更广泛和更详细的画面。这种组合数据面临巨大分析挑战，但有可能揭示对细胞身份、功能和可能的细胞相互作用网络的深刻见解。scRNA-seq领域的一个紧迫问题是，在每项研究中，对大量“新”细胞亚群进行临时注释。在没有任何通用参考的情况下，这些独立研究中相似甚至相同的细胞状态和亚群被赋予了不同的名称，从而产生了巨大的混乱。为了开始解决这个问题，scRNA-seq 整合工具将来自不同数据集甚至跨生物体的特定细胞类型被映射到同一空间。这些方法很重要（1）定义不同组织和病理状态的相似细胞亚群/状态，从而（2）定义在特定疾病或所有患有一系列疾病（如癌症或自身免疫）的患者中转录组或频率改变的群体。![]()
Mulder et al., 2021, Immunity 54, 1883–1900通过数据集集成可以实现的另一个重要进展是识别无法在较小的独立数据集中解析的稀有细胞亚群。最后，scRNA-seq集成允许将多个维度和模型组合到一个数据集中，并跨具有互补元数据的数据集：例如，一个数据集可能包括来自特定疾病患者的健康和病理组织，而另一个数据集可能包含来自受试者或动物模型的细胞处于该疾病发展的不同阶段。结合这些维度的信息扩展了超出任何单个研究通常可以实现的范围，从而提高我们对在不同条件下发现的细胞亚群之间的机制和同源性的理解。整合还提供了组合从不同物种获得的数据集的可能性，从而使我们能够定义潜在的直系同源细胞亚群，向前迈出的重要一步是在单细胞水平上整合mRNA和蛋白质标记。利用条形码标记抗体对单个细胞上一百多种不同特定表面蛋白进行定量的新技术，并结合生成细胞的转录谱，通过测序（CITE-seq）对转录组学和表位进行细胞索引，以及RNA表达和蛋白质测序（REAP-seq）。最近，这些技术进一步扩展到细胞内蛋白质检测，能够结合转录组
（INs-seq） 分析细胞信号传导和代谢途径。这对于鉴定主要区别特征不在细胞表面表达的细胞类型特别有用，例如髓源性抑制细胞（MDSC），其主要通过其特定的代谢特征来区分。使用INs-seq，代谢和信号信息可以与转录分析相结合。![]()
Katzenelenbogen et al., 2020, Cell 182, 872–885影响免疫细胞生物学的另一个重要因素是转录和基因活性的表观遗传调控。转座酶可接近开放染色质（ATAC-seq）单细胞分析，分析转座酶可接近的“开放”基因组区域。2019年，几个小组还开发了实验方法，使用与 scRNA-seq 耦合的代谢标记将转录组与时间信息联系起来：scSLAM-seq和 NASC-seq,都基于 RNA 核苷酸的代谢标记来剖析 RNA 合成的动力学并生成基因表达谱的时间足迹。单细胞基因组学领域的概念始于在单细胞水平上探测生物系统的愿景，但最初缺乏实现这一梦想的资源和技术。从那时起，研究界投入了巨大的精力来开发和公开分享新颖的单细胞技术和数据。新的多组学单细胞技术和分析预计将以越来越快的速度继续发展：最初的scRNA-seq研究主要是探索性的，主要作为原理验证演示，而现在我们开始看到这些方法的真正力量，以生物学和临床相关的方式推动新发现和完善现有知识。从癌症患者生成的大量免疫图谱将能够检测参与抗肿瘤反应的关键免疫人群和途径，并开发有效的生物标志物和下一代免疫疗法靶点。使用单细胞多组学技术快速剖析免疫特征的另一个例子是在急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）表征的快速发展。在整个 COVID-19 大流行爆发期间，免疫学界积累了大量工作以确定参与SARSCoV-2 病理学的细胞和信号通路。![]()
在临床试验和其他环境中，从治疗前和治疗后不同时间获得的序贯活检中分离细胞，提供了一种在单细胞水平上定义癌症等疾病治疗或进展后发生的分子事件的新方法。这些数据将通过加速（1）开发可靠的诊断和预后标志物，（2）建立模型，允许预测每个患者对个体患者进行的最佳治疗，（3）发现新的治疗靶点，以及（4）基于其精确作用方式开发免疫治疗分子，从而彻底改变我们诊断和治疗疾病的能力。参考资料
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