细胞外通量分析（Extracellular flux analyzers,EFA）细胞外通量分析仪（EFA）（例如安捷伦 Seahorse XF 分析仪）可以表征和验证生物能量活性的广泛差异。EFA同时测量主要生物能量途径的活性，即线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解。为了同时测量 OXPHOS 和糖酵解，EFA使用带有两个传感器的光纤探头来量化氧气水平和培养基 pH 值随时间的变化（即分别是耗氧率 （OCR） 和细胞外酸化率 （ECAR）。![]()
P.A. Kramer et al. / Redox Biology 2 (2014) 206–210OCR通常反映线粒体OXPHOS，而ECAR主要由乳酸释放到培养基中驱动，则反映糖酵解。EFA 的另一个实用功能：能够在运行过程中向每个孔中注入多达四种化合物或混合物，并实时检测细胞对这些化合物的即时反应。例如，可以注射感兴趣的代谢途径抑制剂以检查代谢能力和适应，或者可以注射PMA以测量T细胞活化时的代谢活性。在该测定中，样品首先在葡萄糖饥饿条件下平衡。然后，注射葡萄糖以测量基础糖酵解活性以响应葡萄糖可用性。接下来，为了评估糖酵解能力（即最大糖酵解），注射寡霉素（ oligomycin）以抑制线粒体ATP合酶，并强制使用糖酵解作为ATP的主要来源。将代谢活动转变为主要依赖糖酵解的能力也告知细胞的代谢灵活性。最后，注射2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）以抑制糖酵解，并确认ECAR测量值，反映糖酵解活性。尽管ECAR量化了培养基酸化的程度（主要由糖酵解活性（即乳酸产生）驱动），但OXPHOS产生的CO2很容易水解成碳酸氢盐，随后使培养基酸化，影响ECAR分析结果。因此，糖酵解速率测定现在是糖酵解EFA的首选测试，因为它可以区分糖酵解和线粒体酸化，糖酵解读数更具特异性和更可靠。当研究对象是OXPHOS 时，则选择线粒体应激测试。线粒体应激试验可以通过电子传递链（electron transport chain，ETC）抑制剂的顺序处理来研究线粒体生物学的许多方面。在基础OCR测量之后，注射寡霉素以抑制ATP的产生，有助于质子梯度超极化。接下来，注射FCCP（cyanide-4-trifluoromethoxyphenylhydrazone）使线粒体膜去极化以消散质子梯度，产生最大的ETC活性，以努力重新建立线粒体功能所需的电化学梯度。此 OCR 可量化最大呼吸。最大 OCR 和基础 OCR 之间的差异代表备用呼吸能力，或为响应细胞应激（通常称为代谢适应性）而保留的能量。最后，共同注射复合物I抑制剂鱼藤酮和复合物III抑制剂抗霉素A以关闭ETC功能，并作为验证OCR与ETC活性之间关系的手段。底物氧化应激试验可用于检查葡萄糖、谷氨酰胺或脂肪酸如何支持线粒体代谢。用于线粒体氧化的三大类底物，特别是在细胞培养中，是丙酮酸、谷氨酰胺衍生的α酮戊二酸和长链脂肪酸（LCFAs）。为了确定特定底物的利用率，注入感兴趣回补反应(anaplerotic reaction)抑制剂，然后进行线粒体应激试验。依托莫西在低浓度下靶向肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1），可用于通过阻断脂肪酸转运到线粒体中来抑制LCFA氧化。UK5099靶向线粒体丙酮酸载体（MPC），该载体抑制丙酮酸穿梭在线粒体中。BPTES可用于抑制谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶（GLS1）脱酰胺为谷氨酸。在鉴定驱动线粒体代谢的主要营养素后，对每种途径抑制剂进行序贯处理可以评估其他底物是否可以补偿以恢复线粒体呼吸。免疫细胞代谢存在异质性，但EFA技术无法捕获单细胞代谢信息。因而单细胞方法出现，以解决相关问题。流式细胞术是用于代谢特征分析的最简单、信息最丰富的基于单细胞的方法之一。市售的代谢物荧光染料和/或类似物丰富且相对易于使用。与荧光标记的底物一起孵育的免疫细胞将用内源性转运蛋白占据底物。在洗涤培养基中的任何外源性底物后，细胞的流式细胞术能够定量该底物的代谢物摄取。这些检测具有需要小细胞数的额外优势，使流式细胞术成为快速验证代谢活性差异的常用方法。用于葡萄糖摄取：2-（N-（7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二氮唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）半胱氨酸-FITC探针在人T细胞和B细胞中显示出活化诱导的半胱氨酸摄取。mTOR和AMPK信号传导在调节免疫代谢方面具有重要作用，可以通过活性激酶和磷酸化底物的磷酸流监测。CyTOF可实现流式细胞术的多重分析，通过基于抗体的代谢标志物、细胞类型指标和信号状态激活进行分析，增强其允许的维度。表面标志物可用于多达 40 种可用测量，可用于鉴定细胞亚群以及代谢标志物、细胞因子和活化标志物的细胞内染色。![]()
Nat Biotechnol. 2021 February ; 39(2): 186–197
单细胞RNA测序（scRNA-seq）在免疫学广泛应用，发现了新的免疫细胞群和谱系。在活性免疫细胞中高度表达的代谢酶可以通过scRNA-seq技术进行很好的定量，并且可以发现免疫细胞功能和/或命运的新调节因子，更好地表征免疫细胞亚群及其代谢基因特征，以及参与其稳定性和功能的关键调节因子。代谢组学的进步，使得可以同时测量数十到数千种代谢物，并发现在生物学中具有新作用的代谢物。![]()
Annu. Rev. Immunol. 2023. 41:317–42代谢物周转可以在几秒钟到几分钟的时间尺度上发生。因此，快速样品收集和代谢淬灭对于准确的代谢物测量至关重要。这需要在收集之前对样品的干扰最小，并在收获期间立即进行酶灭活，以捕获反射生物系统的代谢组。因为通常需要使用基于流式细胞术的分选或磁珠纯化感兴趣的免疫群体，该过程可能需要相当长的时间，并且在低营养缓冲液中进行，允许代谢物交换和扩散。在标准培养条件下短时间孵育分离的细胞可以提供在分选后恢复代谢稳态所需的营养。或者，磁珠介导的富集可以实现更快的纯化方法，同时将代谢物损失降至最低。考虑代谢物提取和加工所涉及的方法以确保检测感兴趣的代谢物。例如，水性代谢物很容易使用水性/极性溶剂（例如甲醇和水）提取;丁醇和甲醇中的非极性代谢物;而甲醇和氯仿的混合物可提取具有亲脂性的极性和非极性代谢物。常见的液相色谱方法需要复溶代谢物提取物，然后根据极性或疏水性进行分离。对于气相色谱，代谢物根据挥发性进行汽化和分离。质谱法检测带电分子。因此，对分析物进行电离，以便根据其相对质量和电荷通过质谱法进行检测，然后对分析物丰度进行定量。常规质谱仪器分为TOF，离子阱（IT）和三重四极杆（QqQ）。由于代谢组的多样性和复杂性，仪器和相关技术通常经过优化以检测感兴趣的代谢物。例如，QqQ仪器在检测预定义分析物方面具有高度选择性，并且为已知代谢物的定量提供了最佳灵敏度。相比之下，TOF和IT仪器可用于非靶向分析，以非预定方式分析给定样品中更广泛的代谢物。值得注意的是，没有单一的技术，甚至技术组合，能够评估给定样品中的所有代谢物。—在单个时间点进行的代谢组学测量静态代谢物水平，并相应地考虑相关分析。例如，代谢物库大小的增加可能反映了产量的增加或消耗量的减少。可以采用三种技术来检查通路活动。首先，多个时间点的代谢物采样（通量分析）可以评估代谢物水平随时间的变化。其次，同位素示踪代谢组学可以量化有助于特定代谢物水平的途径活动。在该技术中，营养输入由非放射性同位素示踪剂组成，例如13C，15N或2H;这些同位素中的每一种都比其天然存在的对应物（即12C，14N或1H）重一个道尔顿。代谢组学研究中常用的同位素示踪剂包括均匀标记的葡萄糖（13C6-U-葡萄糖）和谷氨酰胺（13C5-U-谷氨酰胺）。通过其同位素标记模式来评估代谢的富集，该模式可以识别活跃的途径并有助于特定代谢物的积累。为了比较差异途径活性，位置标记的示踪剂可以揭示标记底物的分配，如[1,2-13C]葡萄糖富集到核糖中作为磷酸戊糖途径活性的读数。当与免疫表型配对时，同位素示踪代谢组学已成功确定糖酵解中间体，谷氨酰胺，精氨酸，乙酸酯，蛋氨酸和单碳代谢作为免疫细胞活性调节剂。最后，通量组学通过将同位素示踪和通量分析与生化反应的计算建模相结合来量化代谢途径活性。简而言之，细胞内和细胞外代谢物在通过特定途径捕获示踪剂掺入和周转的时间点进行定量，称为动态标记。通过将转录组学和蛋白质组学的数据与代谢组学相结合，系统生物学方法可用于推断从示踪剂到特定代谢物的转化途径和速率。![]()
Annu. Rev. Immunol. 2023. 41:317–42
测试酶和代谢途径在体内作用的直接方法是直接在基因上破坏该途径。反向遗传方法，其中从给定代谢途径中选择的单个基因被靶向或改变以确定该途径的表型和作用，已经揭示了不同细胞群中特定代谢程序的关键体内功能。这些策略仍然是理解免疫代谢中的代谢信号和因果关系的主要支柱，包括证明虽然效应T细胞需要葡萄糖转运蛋白GLUT1，但Treg细胞可以独立于体内的GLUT1发挥作用。此外，正向遗传策略可以筛选基因集，甚至整个基因组，以对特定表型产生影响。CRISPR引导RNA（gRNA）序列算法的进步大大提高了靶向效率并减少了脱靶效应。通过将Cas9和混合的gRNA组合递送到造血干细胞（HSC）或免疫细胞，可以通过高通量筛选破坏和快速分析感兴趣的代谢途径，以确定靶向指导特定表型的基因的富集或消耗。Little ACet al.High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights
into mitochondrial properties and functions. Commun. Biol. 3, 271 (2020).Hartmann FJet al.Single-cell metabolic profiling of human cytotoxic T cells. Nat. Biotechnol. 39,
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