细胞因子检测/定量主要依赖于免疫检测。免疫检测利用抗体的高灵敏度和特异性来检测目标蛋白，常见的免疫测定大多可达到 1–100 pg/mL 蛋白质浓度的灵敏度。酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）于1971年被开发[Engvall, E.; Jonsson, K.; Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.Biochim. Biophys. Acta 1971, 251, 427–434；Van Weemen, B.K.; Schuurs, A.H.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 1971, 15,232–236]，是基础研究和临床检测中单一指标定量的关键技术。商业化ELISA最常用的是三明治夹心法ELISA，特异性好。此外，还有直接法ELISA、间接法ELISA、竞争法ELISA等应用于不同场景。![]()
几种常见ELISA比较（Journal of Natural Medicines (2018) 72:32–42）尽管蛋白质印迹法在40年前就已经被开发出来[Towbin, H.; Staehelin, T.; Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76, 4350–4354.]，通过抗体和分子量信息（和ELISA比较）提升特异性，化学发光技术的飞速发展，显著提升了检测灵敏度，因而它依然是蛋白质检测相对定量的关键而强大的技术。与适用于溶液中细胞因子检测的ELISA不同，蛋白质印迹法更适合分析复杂生物样品和组织中的细胞因子。虽然蛋白质印迹可能不如ELISA敏感，但其提供蛋白质分子量信息是不可替代，尤其对有剪切体的细胞因子，也可区分无活性前体和活性形式。例如，IL-1β是一种促炎多效性细胞因子，前体为31 kDa，由Caspase-1加工成成熟，其活性形式为17 kDa。尤其在实体瘤等研究中，蛋白质印记的重要性凸显。蛋白质印迹也可使用磷酸化位点特异性抗体研究细胞因子（受体）磷酸化。例如，葡萄膜黑色素瘤细胞系中的VEGF受体磷酸化，以监测VEGF-A及其抑制剂（贝伐珠单抗）对细胞增殖、迁移、侵袭和其他细胞因子产生的影响。蛋白质印记可以区分细胞因子细胞核和细胞质定位。大多数细胞因子在分泌前位于产生细胞的细胞质中。然而，某些细胞因子（例如IL-1家族成员IL-1α，IL-33和IL-37）已检测到核定位。IL-1α的核定位主要见于静息细胞，其中IL-1α可能作为调节细胞生长和分化的转录因子。电化学发光（ECL）是一种将电能转化为光发射的电化学反应。第一个ECL免疫测定法是在上世纪九十年代开发的[Obenauer-Kutner, L.J.; Jacobs, S.J.; Kolz, K.; Tobias, L.M.; Bordens, R.W. A highly sensitive
electrochemiluminescence immunoassay for interferon alfa-2b in human serum. J. Immunol. Methods 1997,
206, 25–33.]，利用钌配合物进行电化学发光反应。目前，ECL广泛用于临床，临床前和基础研究。ECL免疫测定平台主要包括Meso Scale Diagnostics（MSD）公司QuickPlex SQ120等，结合其平板抗体芯片，检测线性范围可以达到4-6个数量级，灵敏度可达亚皮克级。![]()
MSD官网
基于微球的多重检测是最常用的多重细胞因子检测形式，具有高精度、灵敏度、重现性、宽动态定量范围、高通量以及使用低至 25 至 50 μL 样品定量多种分析物的能力。这种液体芯片主要基于夹心ELISA的原理。经典的测试仪器包括流式细胞仪和Luminex。在典型的Luminex设置中，红色激光（分类激光）激发磁珠内部染料以识别每个微球颗粒（分析物）。同时，从藻红蛋白的荧光强度量化细胞因子量，藻红蛋白已被绿色激光（检测激光）激发。使用Luminex测定，理论上可以同时测量多达100种，甚至几百种分析指标。然而，为了避免抗体的交叉反应等，一个组合一般可以测试30种分析指标。基于磁珠的液体芯片检测范围可达 3–4 个数量级，灵敏度达到1-10皮克/mL 。使用精密反向移液和优化的标准品稀释，某些细胞因子的检测下限可能扩大到1 pg/mL以下。![]()
抗体芯片是一种可靠而稳健的方法，用于从复杂蛋白质组中提取多重数据，具有高灵敏度、高特异性和高通量。第一个抗体芯片是由Chang于1983年开发的，在1cm2面积的玻璃盖玻片上发现了10×10和20×20网格中的抗体[Chang, T.W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods
1983, 65, 217–223]。当前抗体芯片多用三明治夹心或直接标记，使用化学发光或者荧光进行检测。![]()
三明治夹心抗体芯片使用抗体对，必须验证和检查与阵列中所有其他抗原/抗体的交叉反应性。出于这个原因，芯片一般涵盖10到80个分析指标。通过组合多个阵列，可以检测和定量人体样品中多达1000种分泌的人类蛋白质，如细胞因子、趋化因子、脂肪因子、生长因子、蛋白酶、可溶性受体和其他蛋白质。此外，小鼠、大鼠、牛、羊等不同种属的芯片，也有开发。质谱（MS）是蛋白质组学中的一项基本技术，适用于蛋白质鉴定和定量。在经典的蛋白质组学工作流程中，蛋白质被分离（可以添加富集或预分级步骤）并通过特定蛋白酶（例如胰蛋白酶）消化为较小的肽。然后对肽进行浓缩和脱盐，通过高效液相色谱（HPLC）分离，电离并通过MS进行分析。串联质谱仪（MS / MS）测量MS实验中肽（母离子）及其碎片离子的精确质荷（m / z）比。![]()
Metzemaekers M, et al， (2021) From ELISA to
Immunosorbent Tandem Mass
Spectrometry Proteoform Analysis:
The Example of CXCL8/Interleukin-8.
Front. Immunol. 12:644725.
doi: 10.3389/fimmu.2021.644725
这种方法可以对肽/蛋白质进行非常特异性的鉴定和定量。尽管MS是一种强大的蛋白质组学技术，但在细胞因子分析中的应用具有挑战性。应考虑MS的几个局限性：（1）MS只能检测带电（电离）肽，但并非所有肽都以相同的效率电离。此外，低分子量的蛋白质（包括大多数细胞因子）提供的肽较少，并且与丰度低，如果不进行富集或预分馏，这些肽将无法检测到。（2） 鸟枪法MS的灵敏度通常不足以检测复杂生物样品（血清或血浆）中的低丰度蛋白质（如细胞因子）。例如，人血浆中血清白蛋白和IL-6的浓度相差10个数量级。（3）基于MS的方法具有高度重现性，但质量控制（例如，内标蛋白质/肽）对于控制蛋白质消化功效、HPLC肽分离和MS性能至关重要。鸟枪法蛋白质组学（数据依赖性采集（DDA），见下文）是部分随机的，因为根据离子信号强度通过计算机控制的算法选择母离子进行碎裂，因此重复分析同一复杂样品可能会产生略有不同的鉴定蛋白质列表，特别是在蛋白质丰度低的情况下。另一方面，靶向方法（(selected reaction monitoring，SRM或 multiple reaction monitoring/MRM））不会遇到此问题，并提供可靠且可重现的分析。（4）蛋白质鉴定依赖于蛋白质数据库，并且可能对非人类生物体（例如，生物医学研究中使用的动物模型）的覆盖率不足。MS方法提供了相对容易的多重检测能力和更高的特异性，但灵敏度低于免疫检测。单分子计数（. Single Molecule Counting，SMC）技术最初由Singulex公司开发，将基于磁珠的免疫测定与单分子计数检测相结合[Wu, A.H.B.; Fukushima, N.; Puskas, R.; Todd, J.; Goix, P. Development and preliminary clinical validation of
a high sensitivity assay for cardiac troponin using a capillary flow (single molecule) fluorescence detector.
Clin. Chem. 2006, 52, 2157–2159.]。经典的 96 孔板中，基于磁珠的免疫测定法用于形成夹心复合物（捕获抗体-抗原-荧光标记的检测抗体包被的磁珠）。然后，破坏夹心复合物，并使用专有的数字SMC技术分析洗脱的荧光标记检测抗体，使用激光共聚焦显微镜数字计数器对单分子荧光信号（“闪光”）进行计数。SMC 检测试剂盒可检测人体样品中的细胞因子，灵敏度为 sub-pg/mL。单分子阵列（Simoa）由Quanterix
Corp.开发，是一种数字ELISA，灵敏度可达亚fg/mL浓度。Simoa基于经典的夹心免疫测定磁珠，然后进行数字检测。抗原被固定在磁性微珠上的抗体捕获，并通过添加生物素化检测抗体和链霉亲和素标记的酶，形成免疫复合物。然后将磁珠加载到由50，000个孔（46fL孔，每个孔只能容纳一个磁珠）组成的微孔阵列中，并在荧光底物存在下密封。由于反应体积极小，即使孔中仅存在一种酶分子，荧光产物的浓度也很容易达到可检测范围。目前可以同时测量多达10种分析指标，灵敏度0.01–0.03 pg/mL。免疫PCR最初描述于1992年[ Sano, T.; Smith, C.L.; Cantor, C.R. Immuno-PCR: Very sensitive antigen detection by means of specific
antibody-DNA conjugates. Science 1992, 258, 120–122]，结合免疫测定的高特异性和聚合酶链反应（PCR）的高灵敏度。与传统ELISA中底物和产物之间的线性关系相比，聚合酶可实现信号指数级放大，灵敏度比普通ELISA高1000倍。夹心形式的免疫PCR，与夹心ELISA相同，在捕获抗体包被的96孔板中进行。与 ELISA 测定中用于检测的酶抗体偶联物不同，免疫 PCR 利用与 DNA 共价偶联并通过定量 PCR 检测的检测抗体。![]()
Niemeyer, C.M.; Adler, M.; Wacker, R. Detecting antigens by quantitative immuno-PCR. Nat. Protoc. 2007, 2,
1918–1930
虽然免疫PCR的优点是显而易见的（例如，超灵敏、良好的重现性和普遍性），但其主要局限性是背景高且需要大量的洗涤步骤。邻近连接测定（proximity ligation assay，PLA）最初由Fredriksson等人开发[Fredriksson, S.; Gullberg, M.; Jarvius, J.; Olsson, C.; Pietras, K.; Gústafsdóttir, S.M.; Ostman, A.; Landegren, U.
Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 473–477.]，他们使用对血小板衍生生长因子（PDGF）具有亲和力的DNA适配体来量化PGDF。同源二聚体PDGF-BB可以容纳两个适配体分子，每个分子都具有引物结合的延伸和额外的延伸，在杂交到共同的连接器寡核苷酸时进行连接。PCR产物的实时检测可检测到低至10−20摩尔蛋白浓度。邻近延伸测定（Proximity Extension Assay，PEA）是PLA的替代方法。两种技术的主要区别在于，PLA的连接事件被PEA中的DNA聚合步骤所取代，从而最大限度地减少了背景噪声并提高了测定灵敏度[Greenwood, C.; Ruff, D.; Kirvell, S.; Johnson, G.; Dhillon, H.S.; Bustin, S.A. Proximity assays for sensitive
quantification of proteins. Biomol. Detect. Quantif. 2015, 4, 10–16]。目前Olink对该技术进行了商业化， 可在 1 μL 样品同时分析数十种生物标志物。2006年首次描述了磁减量生物分析技术[Hong, C.-Y.; Wu, C.C.; Chiu, Y.C.; Yang, S.Y.; Horng, H.E.; Yang, H.C. Magnetic susceptibility reduction
method for magnetically labeled immunoassay. Appl. Phys. Lett. 2006, 88, 212512]。目前的免疫磁减量（IMR）测定，将捕获抗体固定在磁性纳米颗粒。这种纳米颗粒均匀分散在溶液中，并通过施加外部多个磁场（即易受磁场影响）而振荡。加入分析样品后，由于抗体捕获分析物分子，纳米颗粒变得更重，导致纳米粒子对磁场的响应降低，降低程度对应于样品中存在的目标分子的量，能够检测pg/mL浓度的蛋白质IMR测定的主要优点是它是一种简单的技术，不需要洗涤步骤即可去除未结合的试剂，具有高度的灵敏度和定量性。例如，淀粉样蛋白-β1-42和α-突触核蛋白的浓度范围分别为1-50，000pg/mL和0.3fg/mL–300pg/mL。与夹心免疫测定不同，IMR测定仅使用一种抗体（“捕获”抗体）。测定特异性通过纳米颗粒的振荡运动来确保，其中微弱的非特异性抗原 - 抗体相互作用由于施加磁场在纳米颗粒上引起的离心力而被破坏。IMR测定目前旨在识别疾病的早期阶段，例如神经退行性疾病，癌症和病毒感染。酶联免疫斑点（ELISpot）检测最初是为检测抗体产生细胞而开发的[Czerkinsky, C.C.; Nilsson, L.A.; Nygren, H.; Ouchterlony, O.; Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked
immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J. Immunol. Methods 1983,
65, 109–121. ]。后来，用于计数人外周血淋巴细胞中分泌IFNγ的活化T细胞。从那时起，ELISpot作为一种简单且高度定量的检测方法开始流行，用于检测产生单细胞的细胞因子和监测细胞对各种刺激的反应。1. 细胞内细胞因子染色，可以同时获取分泌细胞因子的细胞及细胞群信息。在细胞内细胞因子染色中，细胞被激活以产生细胞因子，同时通过阻止细胞因子分泌的物质（如Brefeldin A或monensin）处理，随后，细胞被固定并透化，以允许特异性抗细胞因子抗体结合。（Schuerwegh, A.J.; Stevens, W.J.; Bridts, C.H.; De Clerck, L.S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow
cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha in monocytes.
Cytometry 2001, 46, 172–176.）2009年，Bandura等人开发了结合流式细胞术和质谱法的新方法——质谱细胞术（也称为CyTOF）[. Bandura, D.R.; Baranov, V.I.; Ornatsky, O.I.; Antonov, A.; Kinach, R.; Lou, X.; Pavlov, S.; Vorobiev, S.;
Dick, J.E.; Tanner, S.D. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based
on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 2009, 81, 6813–6822.]。这种方法允许对理论上每秒高达3000个细胞进行实时定量单细胞分析，并同时测量一个细胞中的60个不同的标记物（蛋白质或其他生物分子）。抗体与元素标签（金属的稳定同位素）而不是荧光染料偶联。单个细胞的反应（例如，癌症抗原刺激的T细胞）可以通过目前开发的用于单个分泌组分析的微量工具来监测。在带阀微流控室（类似于用于单细胞RNA测序的微流控芯片）或亚纳升孔阵列中，可以将单细胞容纳到分离的隔室中[. Chattopadhyay, P.K.; Gierahn, T.M.; Roederer, M.; Love, J.C. Single-cell technologies for monitoring immune
systems. Nat. Immunol. 2014, 15, 128–135]。用于分泌细胞因子的初始单细胞阵列采用在聚（二甲基硅氧烷）平板上模制的81，400微孔（每个~0.1nL）。将阵列加载PBMC细胞（每孔~1个细胞），然后倒置到涂有特异性捕获抗IL-6或抗IFNγ抗体的载玻片上。孵育后，加入与荧光染料偶联的适当检测抗体，并通过微阵列扫描仪记录荧光。[Bradshaw, E.M.; Kent, S.C.; Tripuraneni, V.; Orban, T.; Ploegh, H.L.; Hafler, D.A.; Love, J.C. Concurrent
detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive
antibodies. Clin. Immunol. 2008, 129, 10–18。
