摘要
目的 旨在结合转录组测序的结果，聚焦糖尿病视网膜病变中的氧化应激水平和炎症水平，探讨硒结合蛋白1（selenium binding protein 1，SELENBP1）在糖尿病视网膜病变中的作用。
方法 对12周龄的db/m和db/db小鼠的视网膜组织进行转录组测序分析筛选差异基因。实验分为两组：db/m小鼠、db/db小鼠，对视网膜组织切片进行活性氧荧光染色，应用蛋白免疫印迹（Western-blot）检测小鼠视网膜组织中的氧化应激反应相关指标还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）2、NOX4、超氧化物歧化酶2（SOD2）和炎性反应相关指标核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β的变化趋势；用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、Western-blot和免疫组化（IHC）分析组织中SELENBP1的水平。在体外，应用高糖干预人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC），实验分为两组：正常糖组（NG组）、高糖干预组（HG组）检测活性氧水平及氧化应激和炎性因子的表达；在HRMEC细胞中转染SELENBP1质粒和SELENBP1小干扰RNA，分为正常糖对照组（NG+Vector）、SELENBP1质粒组（NG+SBP1）、高糖对照组（HG+si-NC）、SELENBP1小干扰RNA组（HG+si-SBP1），分析活性氧水平及氧化应激和炎性因子的表达水平。
结果 与db/m小鼠相比，db/db小鼠视网膜组织中活性氧含量升高、氧化应激相关因子表达增加、抗氧化因子表达下降、炎性因子表达增加，且SELENBP1的mRNA和蛋白水平都明显升高。体外实验表明，高糖干预HRMEC细胞后，细胞中活性氧水平、氧化应激水平和炎症水平明显升高，SELENBP1的mRNA和蛋白表达均明显升高；在HRMEC细胞中过表达SELENBP1后氧化应激水平和炎症水平明显升高；在HRMEC细胞中敲低SELENBP1后氧化应激水平和炎症水平明显下降。
结论 SELENBP1通过促进视网膜的氧化应激水平和炎症水平加重了糖尿病视网膜病变，抑制该基因的表达可能会成为减轻糖尿病视网膜病变的有效治疗靶点。
【关键词】糖尿病视网膜病变；氧化应激；炎症；硒结合蛋白1
糖尿病的患病率与日俱增［1-2］。糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是非外伤性致盲的主要原因之一。DR分两个阶段——非增殖性DR（NPDR）和增殖性DR（PDR），目前除了控制血压和血糖外，主要靠一些侵入性方法来治疗DR，因此，需要寻找确切有效的非侵入性方法来减缓疾病的进展［3］。
哺乳动物具有高度保守的抗氧化系统，可以对抗组织活性氧的产生［4］。而糖尿病患者中持续的高血糖会增加活性氧的产生，进而激活炎性介质，抑制抗氧化防御机制，最终导致氧化应激。总的来说，活性氧和炎症相互促进，导致糖尿病并发症进一步加重［5-6］。
硒结合蛋白1（selenium binding protein 1，SELENBP1）具有独特的酶活性［7］，在一些基本的生理功能中可能起重要作用［8］，与疾病进程中的氧化应激和炎性反应密切相关，但是SELENBP1与DR之间的关系还未阐明，引起了笔者的关注。
材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SPF级自发2型糖尿病模型db/db小鼠和它的对照组db/m小鼠购自南京大学动物模式研究所。均于天津医科大学朱宪彝纪念医院SPF级实验动物房中饲养。实验动物分组如下：db/m小鼠、db/db小鼠。
1.1.2 细胞系 人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）购于武汉普诺赛生命科技有限公司。培养在DMEM高糖培养基中，于37℃、含5%CO2条件的细胞培养箱中培养。细胞实验分组如下：正常糖组（NG组）、高糖干预组（HG组）、正常糖对照组（NG+Vector）、SELENBP1质粒组（NG+SBP1）、高糖对照组（HG+si-NC）、SELENBP1小干扰RNA组（HG+si-SBP1）。
1.1.3 主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清、葡萄糖溶液培养基补充剂、Opti-MEM I减血清培养基、Lipofectamine 2000 Reagent、聚合酶链反应（PCR）逆转录酶试剂盒、2×SYBR Premix Ex TaqTM、蛋白提取试剂盒、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）凝胶、活性氧检测试剂盒、活性氧荧光探针-二氢乙锭（DHE）。
1.2 方法
1.2.1 小鼠视网膜组织基因测序 分别将db/db小鼠和db/m小鼠的视网膜在无菌操作台中剥离并放入特定收集管中，然后冷链送至华大基因科技有限公司测序。
1.2.2 实时荧光定量PCR 从小鼠视网膜组织样品中或HRMEC细胞中提取总RNA。使用PCR逆转录酶试剂盒合成cDNA。使用2×SYBR Premix Ex TaqTM在CFX 96实时PCR系统上进行定量PCR。
1.2.3 免疫组织化学 将视网膜组织切片用一抗孵育，然后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育，用二氨基联苯胺底物染色，并用苏木精复染。通过光学显微镜评估免疫反应性。
1.2.4 活性氧染色 使用荧光探针来定量视网膜组织和HRMEC细胞中活性氧含量。将10 μmol/L的活性氧荧光探针滴加在视网膜组织或HRMEC细胞上，37℃细胞培养箱内孵育30 min。
1.2.5 蛋白质免疫印迹试验（Western-blot） 首先从视网膜组织或HRMEC细胞中提取蛋白质。然后使用二辛可宁酸法（BCA）法定量蛋白浓度。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，将等量蛋白质移至硝酸纤维素（NC）膜上，密封1 h后，在4℃下一抗处理过夜。再用二抗孵育1 h。最后用增强化学发光（ECL）试剂盒鉴定条带。1.2.6细胞转染用Lipofectamine 2000转染质粒或siRNA 6 h，然后对细胞进行换液，再培养48 h后，收集细胞。
1.3 统计学处理
用GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据分析和绘制统计图。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，用单因素方差分析（one-way ANOVA）对两组的差异进行解析，当P＜0.05表示差异具有统计学意义。
结果
2.1 SELENBP1在db/db小鼠视网膜组织中表达升高
db/db小鼠模型以高血糖为显著特征，体内血糖持续升高会增强机体氧化应激和炎性反应。与db/m小鼠相比，db/db小鼠视网膜组织中活性氧水平明显增高，见图1，用Western-blot检测，db/db小鼠视网膜组织中氧化应激因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）2、NOX4明显升高（t＝4.090、3.276，P均＜0.05），而超氧化物歧化酶2（SOD2）则明显降低（t＝8.188，P＜0.05），炎性因子——核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）-1β趋势明显升高（t＝11.27、5.286、3.378，P均＜0.05），证明db/db小鼠视网膜组织内氧化应激和炎症水平上升，见图2A-C。RNA-seq结果显示，SELENBP1的表达水平变高，见图3A-B。相较于db/m 小鼠，db/db 小鼠视网膜中SELENBP1的mRNA和蛋白表达明显升高（t＝5.831、4.412，P均＜0.05），见图4A-C，且免疫组织化学染色也说明糖尿病组小鼠SELENBP1的蛋白表达明显增高，见图4D。
2.2 高糖干预引起HRMEC细胞中SELENBP1表达升高
接下来进行体外实验，高糖干预后的HRMEC细胞中的活性氧荧光更加明显，见图5A，Western-blot检测可以看到高糖干预HRMEC细胞后氧化应激相关因子NOX2和NOX4的蛋白表达水平明显上升（t＝4.330、5.043，P均＜0.05）、SOD2则明显降低（t＝3.577，P＜0.05），炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-1β在细胞中的表也显著升高（t＝3.741、2.402、5.92，P均＜0.05），见图5B-D，说明高糖状态会使HRMEC的氧化应激和炎性反应水平明显升高。且高糖干预后的HRMEC细胞中SELENBP1的mRNA（t＝1.935，P＜0.05）和蛋白表达（t＝3.502，P＜0.05）明显升高，见图5E-G。
2.3 SELENBP1表达水平升高或者降低时对HRMEC细胞内氧化应激水平和炎症水平的影响
为了证明SELENBP1在细胞水平的作用，采用过表达质粒对于正常糖浓度下的HRMEC进行干预，转染SELENBP1质粒的实验组中，活性氧荧光染色的结果显示在同等糖浓度培养条件下SELENBP1的升高使细胞内活性氧水平升高，见图6A，氧化应激因子NOX2和NOX4升高（t＝5.351、4.129，P均＜0.05）、SOD2则呈降低趋势（t＝11，P＜0.05），炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-1β趋势显著升高（t＝7.992、7.683、4.678，P均＜0.05），见图6B-D，提示SELENBP1的过表达造成了细胞氧化应激水平和炎症水平升高。
在高糖培养48 h后用小干扰RNA敲低细胞中的SELENBP1， 实验发现， 活性氧荧光染色的结果显示同样高糖条件培养下的实验组比对照组活性氧活性明显降低，见图6E。Western-blot的结果显示，氧化应激因子NOX2和NOX4降低（t＝34.53、21.73，P均＜0.05）、SOD2表达升高（t＝13.59，P＜0.05），炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-1β趋势明显下降（t＝7.652、13.82、10.35，P均＜0.05），见图6F-H，SELENBP1蛋白表达降低可以改善HRMEC细胞中氧化应激水平和炎症水平。
讨论
DR是糖尿病引起的主要微血管病变。实验研究表明，db/db小鼠的血浆TNF-α浓度显著升高，并且TNF-α引起db/db小鼠内皮功能障碍。越来越多的证据表明，炎症在DR的发病机制中起重要作用。针对高血糖和其他应激反应，糖尿病中一系列炎性介质上调，可能导致白细胞-内皮细胞的异常相互作用，最终导致视网膜微血管损伤［10］。活性氧的积累会造成应激引起细胞死亡。活性氧调节被认为是对抗β细胞死亡的核心调节剂［11］。炎性反应也与胰岛素抵抗的发展呈现正相关［12］。持续性和长期高血糖会导致有害的慢性炎症损害视网膜组织。糖尿病视网膜中明显存在一种复杂的促炎因子失调环境［14］。值得注意的是，玻璃体中IL-8的平均水平与肺炎或肺结核患者胸腔积液中IL-8的水平相同，且与PDR活性相关［15］。此外，玻璃体中IL-6和IL-8水平的升高与PDR的进展和玻璃体手术的结果相关［16］。这些发现强调炎症在导致PDR的致病事件中是至关重要的。
有报道认为在氧化应激下， 干扰小RNA(siRNA)SELENBP1可治疗过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激［17-18］。SELENBP1是甲状腺转录因子1（Nkx2-1）的直接靶标，可在体内抑制肺腺癌的生长，可以限制与肺癌生长和转移相关的表型，是肺肿瘤生长的重要抑制因子［19］。此外，在人的肝、乳腺和结肠直肠癌细胞系中，SELENBP1抑制谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）的酶活性，而GPX1活性的降低与癌组织侵袭力的降低相关［19］。只有在氧化应激条件下，抑制SELENBP1才能有效增加细胞活力，促进细胞的增殖，抑制凋亡，并且增强GPX1活性［20］。激活NF-κB过量产生的活性氧被认为是高血糖诱导视网膜细胞凋亡的关键介导因子［21］。在糖尿病相关组织损伤的背景下，有害的慢性炎症可能损害视网膜组织［13］。
笔者的结果表明，相较于db/m小鼠，db/db小鼠视网膜组织中SELENBP1升高，在高糖干预后的HRMEC细胞中SELENBP1的表达也明显升高，与组织中一致。在给HRMEC细胞中转染SELENBP1质粒后氧化应激和炎性因子的表达也明显升高，但在高糖干预后的HRMEC细胞中转染si-SELENBP1后，氧化应激和炎性因子的表达也明显下降。以上实验说明SELENBP1在PDR的氧化应激和炎症中起重要作用，为DR的防治提供了新思路。但SELENBP1升高的原因以及在PDR中发挥作用的机制有待进一步研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献 略
END
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