农业灌溉用水中抗生素残留浓度可达ng mL-1 - µg mL-1水平，对作物生长影响较大；然而，水稻与抗生素的相互作用以及水稻早期生长阶段的防御机制仍不清楚。在本研究中，我们研究了水稻幼苗对 0.1、1、6.5和20 µg mL-1浓度的环丙沙星（CIP）的蓄积规律。我们发现逐渐累积的CIP会引起水稻显著的生理变化，包括抑制幼苗根部和叶片生长，光合色素含量降低，这可能是由于活性氧稳态被破坏造成的。整合根部转录组学、代谢组学和验证实验，我们发现水稻幼苗合成了更多的赤霉素A3来触发转录因子（如第VII乙烯转录因子）的表达。首先，我们在水稻幼苗培养体系中添加赤霉素后，发现水稻根叶中CIP的积累显著减少并促进水稻生长；而使用多效唑作为抑制剂破坏赤霉素信号通路可增加根部和叶片对CIP的吸收，同时增加水稻受到的抗生素胁迫，从而支持了这一结论。转录因子激活可诱导代谢重编程以产生更多的脂肪酸衍生物。这些化合物包括二十烷酸、异戊二烯类化合物、脂肪酸和结合物，它们可以作为信号分子、抗氧化剂和能量来源，从而实现水稻的恢复。本章研究证明了水稻中存在一种基于赤霉素的防御机制来防御CIP胁迫，这可能具有重要的环境应用价值，因为我们可以添加少量赤霉素来减少生物累积的CIP，同时促进水稻早期生长（图1）。![]()
灌溉水资源中抗生素等残留污染物对作物生长具有显著潜在风险，引发了人们广泛关注。对以色列445个商业田地的调查显示，灌溉水中各种抗生素的检测率高达99.6%。灌溉用水残留的抗生素不仅会通过食物链迁移；环境浓度也可能会严重影响农作物产量。在中国，一项大规模调查表明，土壤中残留的抗生素会降低农作物产量。在这些污染物中，喹诺酮类抗生素，尤其是环丙沙星（CIP），因其广泛使用和环境持久性而备受关注。然而，环丙沙星在水稻幼苗生长期的蓄积规律和影响，以及水稻如何应对CIP胁迫仍不可知。
如图2A、B所示，叶片对CIP的吸收量在0.1和1 mg·L-1 CIP处理4 d后达到最大量（0.53 μg·g-1和2.28 μg·g-1），10 d后降至0.15 μg·g-1和0.52 μg·g-1；在较高浓度（6.5和20 mg·L-1）下，叶片中CIP的生物累积量在培养10 d后逐渐升高，分别为5.62 μg·g-1和17.03 μg·g-1；相反，水稻幼苗根系在低浓度（0.1 mg·L-1）下，6 d时CIP的积累量达到最大量1.34 μg·g-1，10 d后降至0.46 μg·g-1；同时，随着暴露浓度（1、6.5 和 20 mg L-1）的升高，这些幼苗对CIP的吸收量稳步增加。在第10天，初始暴露浓度为20 mg L-1时根部积累了99.80 µg g-1的CIP。抗生素具有亲脂性和持久性，在木质部蒸腾流中运输水、养分和有机底物的过程中，可以很容易地从根部转移到叶子，这被称为蒸腾-内聚-粘附途径。这些数据表明，植物从其生长环境中吸收这些药物的潜力很大。 Figure 2. Uptake Dynamics of Ciprofloxacin in Rice Seedlings.
然后，我们使用了不同的生理终点，包括根和叶的重量和长度、叶绿素和类胡萝卜素的总含量、细胞内活性氧（ROS）含量和抗氧化酶活性，以了解累积的污染物是否会对水稻产生抑制作用。在CIP暴露浓度下，即使在0.05 mg L-1下，所有测量的含量也逐渐下降，这表明CIP对水稻幼苗具有显著毒性（图3）。叶片生物量和叶片长度的下降可能是由于生物累积的CIP的生态毒理学效应引起的，因为这些有毒化合物会破坏细胞内ROS的稳态，从而导致生物过程（如免疫防御、生殖和发育）功能障碍和强烈的氧化损伤。我们测量了不同浓度CIP下细胞中过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2•-）的含量。如图3A、B所示，随着CIP浓度的增加，H2O2和O2•-含量逐渐增加，经过10天的培养，根部最终增加了27.72-214.45%，叶片增加了34.7-88.93%。ROS在细胞中的积累可导致两种后果：1）在控制水平下，ROS会改变包括酶和受体在内的各种分子的氧化还原状态，从而激活、调节或整合参与应激反应的多种信号转导途径；2）在失去控制的情况下，ROS会由于更强的氧化性而附着在有机成分上。先前的研究还表明，较高浓度的抗生素（如恩诺沙星）会破坏细胞内ROS水平的稳态，同时引起植物的生理变化。抗氧化酶可以清除过量积累的ROS。过氧化物酶（POD）介导过氧亚硝酸盐、有机氢过氧化物和过氧化氢的还原，并负责将超氧化物自由基转化为水。POD最终含量比对照分别高出116.44%～161.64%和125.72%～190.87%倍，证明了这些抗氧化酶在植物防御CIP毒害过程中发挥的重要作用（图4）。![]()
Figure 3. Physiological Effects of Ciprofloxacin on Rice Seedlings.![]()
Figure 4. Levels of Reactive Oxygen Species and Antioxidant Enzymatic Activities of Rice Seedlings under Ciprofloxacin Stress.过量的ROS和抗氧化酶含量是细胞代谢通路改变后输出指标，然而具体哪些细胞通路改变形成了这种结果仍不清楚。为了进一步验证水稻如何防御CIP胁迫，我们对CIP处理的根系进行了非靶向代谢组学和转录组学研究，因为根系在栽培过程中积累了更多的CIP。有趣的是，上调的分子大多是异戊二烯类化合物和氧化脂肪酸中间体，它们可以富集到赤霉素信号转导途径、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和甘油磷脂代谢相关途径中。先前的研究表明，ROS可以作为氧化剂/信号分子诱导植物产生氧化脂质。与之前报道的植物在污染物胁迫下上调抗坏血酸和醛糖酸代谢、和/或氨基酸和有机酸代谢途径的数据不同，这项研究进一步揭示了水稻等植物可以通过合成更多的生长促进和信号分子（如二十烷酸、赤霉素、脂肪酸及其结合物）从CIP毒性中恢复。这些分子诱导代谢重编程，产生更多的植物激素和抗氧化剂，促进水稻幼苗的生长，并清除ROS造成的氧化损伤。
支持这一假设的主要证据是，在暴露于CIP后，赤霉素A3（GA3）和赤霉素A20（GA20）的量分别增加了15.14倍和2.25倍（除非特别说明，本文中所有差异均为Log 2倍变化）（图5A）。赤霉素是众所周知的一种促进植物生长的植物激素。例如，赤霉素促进茎伸长以冒出到空中以躲避洪水。为了证明水稻是否使用GA进行防御反应，我们研究了GA3在水稻暴露期间对CIP的植物毒性和生物累积动力学的作用。如图5B所示，添加10-50 mg·L-1 GA3后，培养10 d后叶片中CIP的积累量从4.84降至2.22 μg·g-1，根系中CIP的积累量从37.0降至19.34 μg·g-1。与CIP积累量降低相一致的是，添加GA3后叶片和根系的长度和生物量均显著增加了100%以上。这些结果表明赤霉素在水稻对CIP胁迫的防御反应中起着至关重要的作用。为了进一步验证赤霉素是否在水稻对CIP刺激的防御反应中起着至关重要的作用，我们使用了一种著名的GA抑制剂多效唑来研究抑制GA合成是否会影响CIP对水稻的影响。如图5C所示，在同样的实验条件下，添加多效唑增强了CIP的毒性及其在叶片和根部的生物累积，这些数据再次表明GA对水稻从CIP毒性中恢复至关重要。
然后，我们使用转录组学、RT-PCR和代谢组学研究了GA为何能帮助水稻从CIP毒性中恢复。环境刺激诱导GA-GID1（GA受体蛋白）复合物的形成，然后通过泛素-蛋白酶体途径下调DELLA蛋白（GA信号转导的关键负面因素）的水平，从而影响种子发芽、下胚轴伸长、开花和种子发育等生物过程。我们也发现，在暴露于CIP后，gid1上调；而GA-GID复合物显著降低了编码DELLA蛋白的两个基因（gaI和slr1）的表达。这些数据使我们得出结论，水稻上调了GA3和GA20的含量，从而诱导随后的代谢重编程以抵御CIP胁迫。
先前的一项研究表明，已鉴定的GID1定位于细胞核中（40）。这表明赤霉素也能调节转录因子，从而在不同环境条件下改变代谢模式。我们还发现，在暴露于较高浓度的CIP时，三种ERF基因（包括ERF.C.3、ERF15和ERF1A）显著上调，最高可达2.08倍。ERF是植物中最大的转录因子家族之一。全基因组分析已在水稻（Oryza sativa）中鉴定出139种VII组乙烯反应因子（ERF），在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中鉴定出122种，根据保守特征，这些因子分别分为15个和12个亚组。转录因子的变化可以重新连接代谢模式，然后我们使用代谢组学来分析改变的途径。最丰富的重编程途径是花生四烯酸代谢，它可以产生更多的二十烷酸（图S10）。如图4D所示，在暴露于0.1和6.5 mg L-1 CIP后，23种已鉴定的二十烷酸（如前列腺素和白三烯）的合成量最多可达到 6.49 倍。二十烷酸可以充当信号分子和/或保护性化合物（如抗菌剂和伤口愈合剂），或作为植物角质层的成分（49）。先前的研究表明，二十烷酸可以由多不饱和脂肪酸（PUFA）形成。我们一致发现，暴露于CIP后，许多脂肪酸和结合物合成更多（图5E）。Figure 5. Roots Metabolomics Unveiled Significantly Differentially Synthesized Metabolites of Rice Seedlings under Ciprofloxacin Stress.
现阶段，随着全球城市化和人口的增加，对水资源和能源的需求不断增加，导致水资源的使用多样化。然而，不同水资源中均发现不同程度的抗生素残留，对植物存在潜在的显著影响。因此，农业灌溉水中的抗生素残留问题一直备受关注。迫切需要全面分析这些新兴污染物在植物中的生物放大潜力和毒性机制，这可能有助于确定一种在环境中有机污染物胁迫下提高植物产量和质量的方法。在这里，我们发现水稻幼苗根和叶对环丙沙星的吸收呈增加趋势，这通过破坏细胞内活性氧的稳态导致其生长显著受到抑制。在评估多组学数据后，我们提出了一个水稻幼苗中用于解毒CIP的综合代谢重编程网络（图6）。在该方案中，抗生素暴露触发植物中赤霉素的合成，从而调节转录因子以改变代谢途径，产生更多的信号分子（主要是脂肪酸衍生物）以构建防线。同时，上调合成的赤霉素也降低了水稻中生物累积的CIP，同时改善了植物的生长。总体而言，我们发现水稻幼苗期使用赤霉素等植物激素可以构建一条调节途径来降低CIP的压力。然而，未来的研究途径（例如基因突变和/或敲除）应该探索不同植物物种和环境背景下赤霉素与各种抗生素之间的相互作用。我们还建议进行田间试验以验证我们的水培研究结果并评估水稻系统中CIP污染和赤霉素应用的现实影响。![]()
Figure 6. Schematic Overview of Defense Responses of Rice Seedlings under Ciprofloxacin Stress.
