细胞内蛋白质降解系统是清除胞内异常蛋白质（如：错误折叠、失去活性、表达量异常增多）的重要过程，维持着蛋白质含量的稳态。蛋白质降解途径主要包括溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径。后者亦称泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS），是胞内蛋白主要降解途径，该系统的三位发现者（Aaron Ciechanover，Avram Hershko，Irwin Allan Rose）被授予2004年的诺贝尔化学奖。UPS重要环节是E3 ligase识别靶蛋白将泛素化标签打上去，蛋白酶体识别泛素化标签引导蛋白质降解。
癌症的发生发展很多时候由于某个蛋白biomaker水平过高，定向蛋白降解（target protein degradation，TPD）应运而生。其中PROTAC因为其模块化的作用机制和合成手段（PNAS | 首篇PROTAC文章精读），一经提出就受到学术界和工业界的追捧，其关键结构是靶蛋白（protein of interest，POI）结合配体和E3 ligase结合配体，再将两者通过linker链接。PROTAC将通过反式桥接（trans）使POI, E3 ligase 在空间上接近，促进POI 的泛素化和降解，最终治疗疾病。相比之下，分子胶概念广泛得多，内涵是增强蛋白-蛋白相互作用，只是分子胶在定向蛋白降解领域发展较快，才有很多人把分子胶和Protac作比较。第一个上市的分子胶降解剂是沙利度胺，该药从“反应停”事件退市后因靶向CRBN重新上市用于治疗多种癌症。
定向蛋白降解（TPD）策略是近年来的热点。大家“主观”上认为PROTAC，由于分子量过于庞大，无法具有较好的生物利用度，更别谈血脑屏障可渗透性了。所以，大家对于分子胶的热情一直都很高涨。如果利用一个小分子，能够选择性诱导蛋白的降解，那么就可以克服掉PROTAC的转化难题。但以往的分子胶，基本都是基于一个E3 ligase ligand，进行衍生化，通过高通量筛选，得到目标分子。这可以称为单价分子胶，或者叫Linkerless PROTAC （我发明的新词）。今天要介绍的这篇Nature，报道了一种新的蛋白降解策略：通过在蛋白内南北两个位点的交联，实现蛋白构象的收缩，从而暴露出新的E3 ligase的结合表面。文章利用体内体外assay，Cryo-EM和基因编辑等各种实验证实了这种新的蛋白降解策略。文章的两位通讯作者Alessio Ciulli和Georg Winter的研究背景是与蛋白质降解相关。各自都曾在PROTAC开山大佬门下工作过，这两位大佬分别是Craig Crews 和James Bradner。
在进入这篇文章前，有几个关键的术语或者实验需要解释一下。
Trans Vs Cis
在化学上，Trans指反式异构，cis指顺式异构，指两个基团或者结构在双键或环的异侧或同侧。本文指目标药物的配体结合到靶蛋白或E3 liagse后，两个配体-蛋白复合基团相对linker在空间上位于同侧（cis）还是异侧（trans）。或者更直观的解释是：trans是蛋白-蛋白间的结合，cis是蛋白内的结合。
图 IBG1以cis连接BRD4的BD1和BD2
基于CRISPR系统的E3 ligase筛选技术（FACS-based CRISPR–Cas9 BRD4 stability screens）
CRISPR系统是一种定向敲除细胞基因的技术，利用靶基因的sgRNA将核酸内切酶cas引导到靶基因处，定点敲除基因。本文设计了一种双荧光BRD4稳定性报告体，使用CRISPR cas9系统敲除细胞内E3 ligase家族蛋白，通过报告荧光进行细胞计数以报告BRD4稳定性的高通量筛选技术。简单来说，目标小分子药物通过泛素蛋白酶体系统实现靶蛋白报告体降解，若是在定向降解途径上的蛋白对应基因被敲除，降解途径被堵住，靶蛋白含量增多，荧光强度增大。因此在小分子给药前后，细胞计数差异显著的基因即为筛选出来的基因。
蛋白降解剂PROTAC或分子胶工作机理的验证流程
前置条件：发现某化合物通过某个E3 ligase介导的泛素化实现靶蛋白降解。
验证是否通过PROTAC机理实现降解：主要是亲和力实验binding assay。PROTAC的主要特征是两个moiety分别结合靶蛋白和E3 ligase，测试该分子与靶蛋白和E3 ligase的亲和力，若分子对两者的亲和力都很大，就能基本确认是PROTAC，可以再通过三元复合物的结合实验佐证。
从机理方面的验证：由于目前对于定向蛋白降解有非常多的概念已经提出来了，几乎所有的蛋白都TACable！但是如何确定是通过UPS途径来实现蛋白降解的呢？一种策略是对细胞施加蛋白酶抑制剂。因为UPS的终点是通过蛋白酶来降解泛素化的蛋白，所以在蛋白酶抑制剂的作用下，目标蛋白POI就无法被降解掉。如果观测到这样的依赖性，那么即可初步确定所得分子是通过UPS途径来实现蛋白降解的。
故事的开始是作者合成了一个专利报道的PROTAC类似物IBG1，该分子具有JQ1（BRD4抑制剂）和E2870（DCAF15抑制剂）两个结构单元，发现其通过泛素-蛋白酶体途径选择性降解BRD4、BRD2。然而这种降解作用却与DCAF15敲降无关，因此作者通过一项基于CRISPR的筛选技术，以BRD4双荧光蛋白作为报告分子，筛选出了DCAF16这一基因。后续验证出，DCAF16基因的敲除能抑制IBG1对BRD4的降解，并减少IBG1对细胞凋亡的促进作用。
因此作者进一步探究DCAF16与IBG1、BRD4究竟是以何种方式发挥作用？
首先排除PROTAC型作用模式后，作者使用了等温滴定量热法、分子排阻色谱等一系列正交试验证明了IBG1能够增强DCAF16与BRD4的亲和力。
不同于化学生物学常用的CO-IP和pull down实验，该文章使用了等温滴定量热法、分子排阻色谱等方法为靶点和E3 lagas结合的热力学过程提供了独特的视角。时间分辨荧光共振能量转移实验证明，IBG1以剂量依赖的方式与BRD4和DCAF16形成三元复合物，此外，IBG1的存在提高了DCAF16与BRD4的亲和力（Kd从1μM降低到712nM），分子排阻色谱SEC实验显示DCAF16与BRD4在IBG1的存在下，一方面稳定了两者的相互作用，另一方面使整个蛋白构象收缩，从而形式上变成更小的蛋白，在SEC上更晚被洗脱下来。
最后，作者拿到了BRD4/IBG1/DCAF16三元复合物的冷冻电镜图像，进一步确定了IBG1的作用方式是以双价的模式结合在BRD4的两个溴结构域的相同活性口袋，引起其构象变化，分子尺寸变小（体现在：分子排阻色谱保留时间增大），增强了DCAF16对BRD4的亲和力，促进BRD4的泛素化和降解。
在双价分子胶策略的启发下，作者意识到可以将IBG1的E2870单元替换成JQ1单元，变成一个JQ1的二聚体IBG3，最后他们发现该分子能够显著提高对BRD4的降解效果，甚至达到皮摩尔级（IBG3）。
最后拓展了一下这个作用模式的E3 ligase 范围：作者又找到另外一个分子IBG4，证明其特异性降解BRD4的作用模式与IBG1相同。不同的是，IBG4结合到另一个E3 ligase 底物受体——DCAF11。这也意味着通过改变另一个结合口袋的受体，能够得到不同构象的蛋白-小分子复合体，从而召唤各式各样的E3 ligase。
总结：这篇文章找到了一种选择性降解BRD4的IBG1，其作用模式是以顺式将BRD4的两个溴结构域紧密连接，从而增强靶点和E3 ligase 的亲和力，最终靶向降解BRD4。从冷冻电镜结构分析作者提出了不同于分子胶和PROTAC的第三种作用模式，即双价分子胶分子内顺式桥接蛋白质的两个domain，以增强靶点和E3 ligase 的表面亲和力，促进靶点泛素化直至降解。
点评：这篇文章的视角放得很大，提出第三种作用模式。这种作用模式依赖于连接蛋白质两个相同domain的链接和空间距离的靠近，显著增强靶点蛋白与E3 ligase的亲和作用，最终靶向蛋白质降解。虽然文章中报道的双价胶水效果极佳，但是这个作用模式的可普及性有待商榷。
同时，这篇工作也给PROTAC药物化学家提出了新的挑战：我们以往发表的那些PROTAC结构也许并不如我们预期的那样，通过链接POI和指定的E3 ligase发挥作用。本文作者正是从一篇PROTAC的专利中，通过非常系统的E3 ligase搜寻，发现了该PROTAC并不招募DCAF15（我觉得这一点有待商榷！），尽管这个双功能分子的另一端连着一个DCAF15的ligand。最后顺腾摸瓜，找到了理性设计分子胶的一点思路。
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