在自然界中，基础萜烯骨架生成后，通常会经历酶促或非酶促的氧化转化，进而产生多样化的结构。迄今为止，仅从Labdane家族中就已分离出数千种具有不同氧化模式的天然产物。近日，上海交大的李健课题组提出了一种策略，结合酶库筛选、定向进化和连续化学氧化过程，系统性地引入Labdane核心的氧化态。他们还通过完成明星分子Nimbolide的形式合成，展示了这种化学酶促方法的功能可行性，突显了其在简化复杂天然产物合成中的潜力。相应的工作发表在JACS之上，划至最下，可直抵原文。
选择性 C–H 氧化反应是有机合成中最重要但也是最具挑战性的转化之一，通常需要引导基团或官能团来实现其化学反应。与化学方法相比，酶催化的氧化过程不仅表现出高度选择性，还对官能团的依赖性低，容忍度高。尤其是它们能够在没有保护基团的情况下实现连续氧化。鉴于这些优势，生物催化逆合成在学术和工业合成应用中已日益成为引入氧化态的首选方法。在我们之前的推文中也预示了生物催化的应用趋势：氧化酶库的构建-反应筛选-定向进化。本文作者即针对这一方向做出了非常漂亮的工作。
首先，选择合成类型的天然产物来进行研究。还记得Renata的一篇Science基本上解决了二萜合成中的绝大多数问题：A环，B环以及C/D桥环的各种氧化态的引入。本文作者选择从商业可及的，或者轻易可合成的几个Labdane的结构出发。这一点非常聪明！可以轻易地探查整个研究思路的可行性。
他们构建了一个包含35种细菌P450单加氧酶、20种真菌P450单加氧酶以及70种α-酮戊二酸依赖双加氧酶的酶库。他们对六种易获得的底物，即sclareolide (1), sclareol (2), Ambrox (3), 8-epi-sclareolide (18), 9-epi-sclareolide (19), and 9,11-dehydrosclareolide (20)，进行了酶库筛选。三种酶对sclareolide (1）表现出有前景的氧化活性，Reetz实验室开发的P450BM3变体KSA15能够高效地氧化sclareolide （1）的C3位点，生成化合物14，产率为93%。
与化合物1、2、3、18和19相比，9,11-脱氢沙龙内酯（20）在他们的酶库筛选中反应最为积极。他们发现了五种氧化酶分别靶向9,11-脱氢沙龙内酯（20）的C2、C3α、C3β和C5四个不同位点（图3）。因此，他们认为该化合物是我们使用的氧化酶库中最优的底物。由Dunming Zhu实验室发现的真菌P450 Sth10在0.4 mM底物浓度下，以76%的产率生成C2产物28。Abe实验室发现的真菌α-酮戊二酸依赖双加氧酶AndA在0.1 mmol/L底物浓度下，对C3α产物29的转化率较低，产率为8%。Renata实验室开发的MERO1和Reetz实验室开发的KSA15均能够高选择性地对9,11-脱氢沙龙内酯（20）进行C3位点的氧化，分别在2 mmol/L底物浓度下以83%和89%的产率生成化合物30。Abe实验室发现的真菌α-酮戊二酸依赖双加氧酶Trt7(52)能够氧化化合物20的C5位点，生成化合物31，产率为51%，底物浓度为1 mmol/L。值得注意的是，C5氧化产物31是天然产物Scapairrin Q(53)，该化合物曾从Scapania irrigua中分离得到。Sth10、Trt7、MERO1和KSA15均表现出合成上的有用规模和高选择性，而AndA的效率需要进一步提高，才能达到合成上有用的活性。
于是他们决定对AndA进行定向进化，以期获得更高的氧化活性（下图）。基于Abe实验室报道的AndA晶体结构，他们选择了酶活性位点的几个氨基酸残基（下图b），并使用22c-trick方法对这些位点进行饱和突变。首先，他们对三个体积较大的氨基酸残基，即Ile69、Ile70和Leu139，进行了饱和突变。令人欣喜的是，I69Y突变体的转化率相比野生型AndA增加了近100倍，在1 mmol/L底物浓度下，C3氧化产物29的产率为49%，同时生成了一种新的C6氧化产物33，产率为51%。
为了提高C6氧化产物33的产率，他们尝试对一些起到π供体和氢键供体作用的氨基酸残基，如Asn120、Asn157和Tyr138，进行饱和突变。此轮突变再次展示了AndA的高效性和可塑性。AndA I69Y的Y138H突变体能够在2 mmol/L底物浓度下以64%的转化率和92%的选择性高效生成C1氧化产物32，而AndA I69Y的N120C突变体则在1 mmol/L底物浓度下以100%的选择性生成C6产物33，尽管转化率略低，为37%。
为了进一步提升C6氧化的效率，他们对AndA I69Y N120C突变体的疏水侧链进行了针对性地丙氨酸筛选。最终，我们鉴定出一个突变体AndA I69Y N120C L175A，该突变体能够更高效地进行C6氧化，在1 mmol/L底物浓度下达到85%的转化率。
什么是22c trick?
22c trick（22个密码子技巧）是一种用于酶工程和蛋白质工程中定向进化的饱和突变策略，旨在有效减少突变库的规模，同时保持对氨基酸多样性的充分探索。在传统的饱和突变中，对目标位点的密码子进行全密码子替换（NNN，64种可能），以编码20种标准氨基酸和终止信号。这会产生一个庞大的突变库，增加了筛选和分析的工作量和成本。
22c trick 方法的核心思想：
精简密码子集合：通过精心设计，选择22个特定的三联体密码子，这些密码子能够编码所有20种标准氨基酸。
减少冗余和无义密码子：避免使用会产生终止信号或不必要冗余的密码子，确保每个密码子都对应一个有效的氨基酸。
降低突变库规模：相比全密码子替换，使用22个密码子可以显著减少需要合成和筛选的突变体数量。
具体实施步骤：
设计简化的密码子集：选取22个密码子（如 NDT、VMA 等组合），这些密码子组合能够编码大部分氨基酸，同时避免终止密码子。
合成简并引物：根据选定的密码子集，设计并合成用于突变的简并寡核苷酸引物。
构建突变库：使用这些引物通过PCR等方法引入突变，构建包含目标位点突变的DNA库。
表达和筛选突变体：将突变的DNA库转化到适当的宿主细胞中，表达蛋白质，并通过高通量筛选或功能测试寻找具有期望特性的突变体。
优势：
提高效率：减少了需要筛选的突变体数量，使实验更具可操作性。
节省成本：降低了合成引物和筛选过程的成本。
覆盖性好：尽管密码子数量减少，但仍能编码所有标准氨基酸，确保对序列空间的有效探索。
示例：
在定向进化过程中，如果对某一关键氨基酸位点进行饱和突变，传统方法需要考虑64种密码子，但使用22c trick，只需考虑22种密码子。这极大地减少了需要构建和筛选的突变体数量。
接下来就是酶催化反应的应用：
我一直觉得这些工作应该是公司里面能够完成的事情，没想到一个初创的课题组就可以做完整个流程，非常厉害！这也从侧面展现出酶催化反应的强大威力。整篇文章的立脚点选得也非常巧妙，能够比较快速地验证自己想法的可行性。文章通讯作者李健老师，在李昂老师那里完成博士学习，然后前往化学酶法合成新星Renata课题组完成博士后训练，2021年回到上海交大任职。
