实验样本对医学或生物学至关重要,特别对于医学人员,
想要研究疾病,临床科研转化,甚至精准医疗实施,都离不开实验样本。
实验样本很多,既可以是人或者实验动物的体液(如血液、尿液、唾液、胆汁、淋巴液、脑脊液、胃液、关节腔液等等)
毛发,肌肉,组织器官(如心脏、肝脏、脾脏、肺组织、胃组织、胰腺、脑等等),也可以是各种微生物,甚至是临床病例资料。
科研最重要的实验样本是生物样本,包括动物的血液、细胞、组织等等。
生物样本获取之后,需要进行一系列处理,例如:
细胞清洗
裂解与细胞内物质的释放
核酸、蛋白质的提取与分离纯化
杂志的去除
微量组分的提取与浓缩等等。
实验样本分类和提取:
核酸
(1)RNA:
用于分子生物学研究的样本主要为RNA和DNA,其中RNA比DNA需要更严格的贮存条件,主要原因是催化RNA降解的RNase无处不在且非常稳定,能使RNA迅速分解,从而导致RNA非常不稳定。
(2)DNA:
用于基因扩增。样本相对容易保存,但需要注意以下事项:抽提好的DNA样本一般可在4℃保存一周,或-20℃保存一个月,若需长时间保存应贮存于-80℃冰箱。
核酸提取
总RNA提取
总RNA中,75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),
其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)及核仁小分子RNA(small nuceolar RNA,snoRNA)等组成。
miRNA提取
MicroRNAs(miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子,如小干扰RNAs(siRNAs),通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达,以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。
基因组DNA
提取进行基因结构和功能研究以及基因诊断,通常要求得到的片段长度不小于100~200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。
质粒抽提
质粒抽提方法即去除RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。
蛋白
用于免疫印迹、质谱等实验,主要来源于血液、细胞或组织提取的蛋白。
细胞
用于形态观察、免疫荧光、免疫组化、电镜观察的原代细胞或细胞株。
组织
用于形态观察、免疫荧光、免疫组化、电镜观察的石蜡切片或者冰冻切片。
实验样本收集,收集最重要全面考虑采集实验样本收集后用途、收集来源、收集类型、收集时间、收集数量、收集的可操作性等多方面因素。
实验样本收集基本原则:
代表性和一致性原则:即对照组和实验组取材部位时间处理过程等要尽可能报保持一致,保证实验可信度。
迅速性原则:实验样本采集到实验时间要尽可能短,防止污染,防止生物降解,防止实效变质变性。
低温原则:所取样本离体后,如有分离步骤应在4℃或冰上等低温条件下进行,分离好的样本立即置于液氮、干冰或-80℃冰箱中,并保证在实验前始终处于-80℃以下,以免样本产生进一步代谢活动,需要保持样本内各种成分的稳定性。
目前生物样本通常的保存温度分为室温、4℃、-20℃、-80℃和-196℃(液氮)。
室温下可以较长时间保存固定的组织切片和石蜡包埋组织;
4℃可以短时间保存待处理的血液和DNA等样本;
-20℃可以较长时间保存DNA样本;
-80℃可以较长时间保存RNA、蛋白质、细胞和组织样本;
-196℃可以长期保存细胞和组织样本。
而生物大分子、细胞、组织和器官的常用储存温度为
-80°C(超低温冰箱)、
-140°C(液氮气相或深冷冰箱)及-196°C(液氮液相),
温度越低样本的稳定保存时间越长。
不同温度对生物样本的影响和保护作用
-60°C~0°C储存:
此温度是水的结晶温度,容易对细胞和组织的微观结构造成损害,一般不使用这一温度来保存组织和细胞。且在组织样本内生物大分子受到细胞组织内多种因素的影响,稳定性有可能明显降低,所以通常样本库不使用-60°C~0°C作为储存温度。
-80°C储存:
-80°C是较常用的样本保存温度,也是常用超低温冰箱所能达到的温度。
基于操作简便性、储存量和成本等因素来考量,这一温度也是目前保存样本中生物大分子活性的常用温度。
但对不同的生物大分子活性来说,这一温度下到底能保持多久的问题仍然处于研究探索中。
组织中 DNA 的稳定性较好,可以在-80°C下保持数年或更长时间。
但 RNA 则容易被广泛分布于细胞和各种组织里的 RNA酶降解。
RNA 在稳定剂中的储存时间一般不超过5年。很多情况下储存一年不到就能检测到RNA被降解。
所以,长期保存 RNA 活性,建议使用更低的温度,或者利用小部分样本提取 RNA与剩余样本同步储存,或者利用含有RNA保护液的专用冻存管储存。例如用RNA later。
RNAlater是一种无毒性组织储存试剂,可在未冷冻的样本中快速穿透组织以在原位对细胞RNA进行稳定和保护。组织块在收集后立即浸没在RNAlater中进行储存,不会影响RNA的质量或数量。RNAlater免去了对组织样本立即进行处理或冷冻在液氮中用于后续处理的需要。
其他样本内的蛋白质和脂类等生物大分子在-80°C下也能保存,但时间长短不一,稳定性逐渐衰减。
另外,目前常见的大型自动化样本存储设备只能和-80°C超低温设备配套使用,尚不能够和液氮设备配套使用。
-140°C储存:
-140°C是低于水的玻璃化温度(-136°C),也是气相液氮罐和深冷冰箱所能达到的温度,
样本在这一低温范围内生物学活动极大降低,
是保存样本中细胞活性的理想温度。
深冷冰箱是电制冷,无需液氮,装满样本后的稳定温度通常在-140°C以下,和使用气相液氮罐相比,其优势在于不需频繁添加液氮,维护方便。
但电制冷的降温速度低于液氮,一旦开启容器取放样本时容易造成较大范围的温度波动,温度恢复时间也相对较长,因而更适合较少开启取放样本的情况。
另外,电制冷冰箱必须保障供电,在断电情况下推荐使用液氮设备以提供备份储存。
-196°C储存:
-196°C是液氮挥发的温度,所以只有液氮液相保存技术能达到此温度。
样本内的生理、生化活动在此温度下基本停止,稳定性状的样本可以得到长期保存。
液氮保存是长期保存样本内细胞活性、组织器官的复杂结构及活性的最有效方法,已广为接受与认可。
与其他不同温度冷冻模式相比,液氮容器液相储存样本需要做好防护样本间的交叉污染。
实验样本的收集方法
(一)细胞
细胞是生物体结构和生理功能的基本单位。
通过体外培养技术获得足够的细胞,可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学、肿瘤学及临床治疗等多种学科的研究工作,
也是开展生物医学研究的重要样本来源。
贴壁细胞
(1)DNA收集操作步骤
1)显微镜观察贴壁细胞,确认细胞状态良好。
2)去除细胞培养液,用3~5mL PBS洗涤1~2次,彻底去除PBS溶液。
3)用胰酶消化后,1 000rpm,室温离心10min,用PBS洗涤沉淀2次后,收集细胞。
4)使用油性记号笔标记清楚样本信息。
5)直接抽提DNA或转移至-80℃冰箱中保存。
(2)RNA收集操作步骤
1)显微镜观察贴壁细胞,确认细胞状态良好。
2)去除细胞培养液,用3~5mL预冷的PBS(RNasefree)漂洗1~2次,彻底去除PBS溶液。
3)按每10cm2培养面积加1mL Trizol试剂的比例加入Trizol试剂(一般实验建议细胞量为1×106个,约需要1mLTrizol)。
4)将Trizol覆盖培养瓶表面的所有细胞,静置10min,以进行充分消化。5)将细胞裂解液转移到1.5mL的RNase-free EP管中。
6)使用油性记号笔标记清楚样本信息。
7)转移至干冰或-80℃冰箱中保存。
(3)蛋白质收集操作步骤
1)从贴壁细胞培养瓶中小心弃去培养液。
2)预温的PBS清洗贴壁细胞2次,小心弃去PBS。
3)配制含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1mL抽提试剂中加入5µL蛋白酶抑制剂混合液、5µL PMSF和5µL磷酸酶抑制剂混合液)。
4)细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(107个细胞中加入1mL抽提试剂;5×106个细胞中加入0.5mL抽提试剂),轻轻摇动5min。
5)用塑料细胞刮将培养瓶壁上的贴壁细胞刮下来,转移细胞悬浮液到离心管中,冰浴下摇动15min进行裂解。
6)裂解液置于预冷的离心机中14 000 rpm、4℃离心15min。弃去沉淀,上清液立刻转移至新的离心管中保存待用。
2.悬浮细胞
(1)DNA收集操作步骤
1)显微镜观察,确认悬浮细胞状态良好。
2)将悬浮细胞收集至15mL离心管,离心(1 000rpm,5min)去除培养液。
3)将保留的细胞用PBS缓冲液快速洗2遍,离心(1000rpm,5min)除去上清液,收集细胞至冻存管中。
4)使用油性记号笔标记清楚样本信息。
5)抽提DNA后直接转移至-80℃冰箱中保存。
(2)RNA收集操作步骤