铁死亡过时了？不，P21和GPX4告诉你旧分子的新玩法，一区文章照样发！

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）就像是关节的“老年痴呆症”，经常会盯上中老年人。它让你的关节软骨逐渐“退休”，同时还会在关节边缘形成一些“小骨刺”，并且关节腔内也会出现滑膜炎症。患上OA，你的关节就会变得疼痛、僵硬、肿胀，连日常活动都受到影响，就像一个“吱吱作响”的旧机器。OA的病因多种多样，遗传、年龄、性别、肥胖、关节创伤和机械应力都是“嫌疑犯”。虽然目前还没有彻底治愈的方法，但我们可以通过药物、物理治疗和手术来减轻症状，改善生活质量。随着医学研究的不断深入，OA的神秘面纱正逐渐被揭开。

在今天的探索中，我们将介绍一项发表在《Free Radical Biology and Medicine》（IF=7.1，PMID: 38176476）的研究。这项研究揭示了P21在OA软骨细胞中的关键作用及其通过调节GPX4蛋白稳定性抵抗铁死亡的机制。通过深入探讨P21在软骨细胞中的作用机制，将帮助我们理解了基因、蛋白质和信号通路的有机结合，为OA的潜在治疗靶点提供了新思路。现在，让我们一起走进这篇文章的世界，揭示其中的关键发现吧！

（1）关节生死劫：骨关节炎治疗的迫切需求

骨关节炎作为一种常见的老年退行性疾病，OA的发病机制复杂，衰老是其风险因素之一。衰老细胞通过分泌炎性细胞因子（衰老相关分泌表型，SASP）导致关节微环境的慢性炎症，从而引起软骨基质降解和软骨细胞死亡。众所周知，细胞外基质（ECM）丧失和软骨细胞死亡是OA发病机制的核心特征。迄今为止，尚无能够改变OA进程的药物。因此，探索导致软骨细胞死亡的机制显得尤为紧迫。

（2）活性氧与铁死亡：骨关节炎的关键因素

近年来的研究表明，活性氧（ROS）和铁死亡在OA进展中起着关键作用。铁死亡作为一种由脂质过氧化物过量积累引起的铁相关细胞死亡，而软骨细胞在炎症和铁超载条件下尤为脆弱。虽然抑制铁死亡被认为是治疗OA的潜在有效策略，但其具体分子机制仍未完全明了。因此，深入研究OA中铁死亡的调控机制，对开发更有效的治疗方法至关重要。

（3）P21的秘密身份：从细胞周期到铁死亡的多面手

P21（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A）不仅是细胞周期的“红绿灯”，还能作为衰老的“指示牌”。它通过阻止细胞凋亡维持细胞稳态，还能独立于P53抑制铁死亡，但具体机制尚不明确。研究表明，P21缺失会加剧类风湿性关节炎（RA）和OA的关节炎症和软骨破坏，但其作用机制存在显著区别。在RA中，P21缺失主要通过增强NF-κB和JAK/STAT通路的活性，促进炎症细胞因子的产生，加剧滑膜炎症和关节破坏；而在OA中，P21缺失主要通过影响软骨细胞的增殖和凋亡，导致STAT3磷酸化增加，进而加速软骨基质蛋白的降解和软骨退化。P21与OA中铁死亡的关系仍需进一步研究。

（1）P21在骨关节炎中的高表达参与软骨代谢的调控

• 研究目的：确认P21在体内和体外骨关节炎软骨中的表达，并探讨其在软骨代谢中的作用。

• 研究方法：

① 体外实验：用IL-1β（10 ng/ml）处理初代软骨细胞24小时以模拟OA细胞模型；用Erastin处理24小时诱导铁死亡；用柠檬酸铁铵（FAC）处理24小时以模拟铁过载。

② 体内实验：使用手术诱导的内侧半月板不稳定（DMM）OA模型和临床OA样本。通过免疫组化（IHC）检测P21在软骨细胞中的表达。

• 实验结果：

① Western blot结果显示，处理组P21显著上调。

②IHC结果显示，DMM组P21阳性软骨细胞数量显著增加，重度OA患者关节软骨中P21阳性软骨细胞也明显增多。

看到这里我们初步可以推测P21是个“坏东西”，它与OA的发生是正相关的。

（2）P21抑制软骨细胞的铁死亡

• 研究目的：探讨P21在软骨细胞铁死亡中的功能。

• 研究方法：

① 使用EdU实验和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验检测敲低P21对软骨细胞增殖和存活率的影响。

② 检测P21敲低对用IL-1β、Erastin或FAC处理后的ROS和Fe2+水平的影响。

③ 使用透射电子显微镜（TEM）观察软骨细胞中线粒体的变化。

• 实验结果：

① EdU和CCK-8实验显示，敲低P21使软骨细胞在Erastin处理下的增殖率和存活率下降，但加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）后得到恢复。

② ROS水平和Fe2+水平在P21敲低的软骨细胞中显著增加。

③ TEM显示，P21敲低的软骨细胞在用IL-1β、Erastin或FAC处理后，线粒体严重收缩或膜破裂。

看到这里我们初步可以推测尽管P21是与铁死亡的负相关的，看到这里大家是不是有点迷惑，既然上面说P21与OA发生是正相关，为什么还能抑制软骨细胞铁死亡呢？不要着急，带着这个疑问我们继续看下去。

（3）P21敲低促进了IL-1β和Erastin诱导的脂质过氧化物积累

• 研究目的：评估P21敲低在氧化应激条件下对软骨细胞脂质过氧化水平的影响。

• 研究方法：

① 在氧化应激条件下检测P21敲低软骨细胞的脂质过氧化水平，包括GSH和MDA的水平。

② 使用流式细胞术检测脂质ROS积累。

• 实验结果

① P21敲低促进了由IL-1β、Erastin或FAC诱导的脂质ROS状态。

② GSH水平降低和MDA水平增加。

③ 流式细胞术显示，P21敲低增加了由IL-1β或Erastin诱导的脂质ROS积累。

这里对P21抑制铁死亡进行了更进一步的验证，看到这里上面的疑惑是不是越来越重了，既然P21是坏东西，怎么开始“洗白了”？

（4）P21独立于NRF2调控软骨细胞中GPX4蛋白水平

• 研究目的：探索P21在软骨细胞中调控铁死亡的更深层机制。

• 研究方法：

① 检测P21敲低对GPX4和SLC7A11蛋白水平的影响。

② 验证P21与NRF2的相互作用及其对NRF2下游基因的调控。

③ 使用NRF2激动剂TBHQ检测其对NRF2和GPX4水平的影响。

• 实验结果：

① P21敲低减少了GPX4的蛋白水平，但对SLC7A11无影响。

② P21敲低显著降低了NRF2及其下游基因HO-1和NQO-1的蛋白水平，P21与NRF2相互作用。

③ TBHQ增加了NRF2及其下游基因的转录和蛋白水平，但无法恢复P21敲低导致的GPX4水平下降。

（5）P21调控GPX4的蛋白稳定性

• 研究目的：确定P21敲低是否通过影响蛋白质合成使GPX4不稳定。

• 研究方法：

① 使用环己酰亚胺（CHX）抑制蛋白质合成，检测P21敲低对GPX4半衰期的影响。

② 使用蛋白酶体抑制剂（MG132和PS341）和溶酶体抑制剂（E64D）检测P21敲低对GPX4蛋白稳定性的影响。

• 实验结果：

① P21敲低缩短了GPX4的半衰期，P21过表达无影响。

② RSL3与CHX共同处理加速了GPX4水平的下降，P21过表达恢复了GPX4的稳定性。

③ 蛋白酶体抑制剂恢复了P21敲低引起的GPX4蛋白水平下降，溶酶体抑制剂无效。

看到这里是不是越来越慌了，怎么和我们想的不太一样啊，P21看样子确实可以抑制铁死亡了，不怕，跟小编一样沉住气，也许后面又会重新“黑化”了呢？

（6）P21调控GPX4的总泛素化水平

• 研究目的：表征P21调控下GPX4的泛素化状态。

• 研究方法：

• 实验结果：

② 转染MYC-Ub过表达载体后，P21敲低仍降低GPX4的泛素化。

③ P21过表达显著上调GPX4的泛素化水平，包括K48-泛素化。

（7）P21通过影响GPX4向LUBAC的招募来调控GPX4的M1-连接泛素化水平

• 研究目的：探讨P21如何通过LUBAC调控GPX4的M1-连接泛素化水平。

• 研究方法：

• 实验结果：

③ M1-连接泛素化水平在Erastin和IL-1β处理后显著增加。

看到这里大家或许有点奇怪，这个M1-连接泛素化又是个什么“东东”？通俗的来讲，它是一种特殊的泛素化形式，泛素分子的N-末端甲硫氨酸（Met1）和另一个泛素分子的C-末端甘氨酸（Gly76）可以直接连接形成线性链，参与信号转导和炎症反应的调控。

（8）P21敲低加剧了OA中的软骨降解并降低了体内GPX4的表达

• 研究目的：评估P21在体内对OA的影响，特别是对软骨降解和GPX4表达的影响。

• 研究方法：

① 使用手术诱导的DMM小鼠模型来诱导OA。

② 通过关节内注射AAV9-shRNA-P21敲低小鼠膝关节中的P21表达，AAV9-shRNA-NC作为对照。

③ 检测GFP表达以确认AAV9感染软骨细胞的效率。

④ 使用Safranin O/快绿染色和IHC检测软骨退变和GPX4水平。

⑤ 使用IHC检测OA标志物（MMP13和Col2a1）的水平。

• 实验结果：

① GFP表达结果显示，注射后3周，AAV9能够高效感染关节软骨细胞。

② 3D重建图像显示骨赘和内侧半月板的不稳定性。

③ DMM手术后，AAV9-shRNA-P21处理的小鼠滑膜炎更严重，滑膜炎评分更高。

④ Safranin O/快绿染色显示，AAV9-shRNA-P21处理的小鼠软骨退变更严重，OARSI评分更高。

⑤ GPX4主要在AAV9-shRNA-NC组软骨的表面区域，而在AAV9-shRNA-P21组软骨中GPX4水平显著降低（图8.g,h）。

⑥ IHC显示，假手术组AAV9-shRNA-P21组的GPX4水平显著低于AAV9-shRNA-NC组。而P21敲低使DMM小鼠软骨中MMP13高表达显著加剧，而Col2a1表达进一步降低。

好吧，看到最后P21还是没有重新“黑化”，似乎彻底“洗白”了。作者这里也似乎是在刻意回避这一问题。其实吧，大家也不用奇怪，这种不正是我们经常会遇见的情况吗？有时候我们的实验做着做着，结果就会变得自相矛盾，但是我们开动脑筋，就以本文为例，P21虽然在OA中表达上调，但其通过调控GPX4的稳定性来抑制铁死亡。

不过细胞发生死亡的方式可不止铁死亡，还有很多其他方式。就本文中通过IL-1β处理软骨细胞模仿OA环境，但是IL-1β可以通过激活NLRP3炎症小体和caspase-1途径，诱导GSDMD的切割和活化，从而促进细胞焦亡。这里作者并没有排除这种情况，所以作者这里的实验设计其实是不太严谨的。

这篇文章的研究发现了在OA中，P21通过调节GPX4蛋白的稳定性来抵抗软骨细胞的铁死亡。研究显示，OA患者和DMM小鼠的软骨中P21的表达显著增加，且在诱导的OA软骨细胞中P21敲除会加剧软骨降解，并促进MMP13的上调。同时，P21敲除还会增加脂质过氧化物的积累和降低GPX4的表达水平，从而增强软骨细胞对铁死亡的敏感性。

P21通过影响GPX4与线性泛素链装配复合物（LUBAC）的结合，调节GPX4的M1-链接泛素化水平，进而调控GPX4的稳定性。整体而言，P21在OA中通过维持GPX4的稳定性，发挥重要的抗铁死亡作用。

（1）P21对GPX4招募到LUBAC的具体机制尚不明确

尽管研究表明P21的表达变化可以影响GPX4与LUBAC组分（如HOIP和Sharpin）的结合，但具体的分子机制仍未阐明，需要进一步探讨。

（2）实验设计不够全面

就像我们上面说的那样，细胞发生死亡的方式可不止铁死亡，这里不是只凭借检测铁死亡的marker蛋白就可以轻易下定论的。那么更严谨的方式该怎么做呢？如果让小编来设计，除了添加铁死亡抑制剂以外，还得添加凋亡抑制剂（Z-VAD-fmk）、坏死抑制剂（Necrostatin-1）及自噬抑制剂（氯喹CQ）在内的多种细胞死亡抑制剂进行细胞活性检测，进行的全面评估。

（3）M1-链接泛素在氧化应激中的作用尚不明确：

尽管研究发现M1-链接泛素在IL-1β或erastin诱导的氧化应激中表现出瞬时增加，但其具体调节机制仍不清楚。M1-链接泛素在调节氧化应激中的作用需要进一步研究。

刚开始看到这篇文章，小编觉得有点惋惜，作者做了这么多只发7分的文章是不是有点亏，不过后来进行一系列综合评估才发现，工作量是sci影响因子的必要条件而非充分条件，把上面的问题都抛开，这篇文章也是勤奋有余而创新不足，选的明星分子有点偏老。大家在做课题设计时不仅要注重工作量，更要注重创新性。如果对课题设计有任何疑问，欢迎与我们交流，一起提升科研水平！

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