在国自然中，非编码RNA翻译蛋白发挥功能（实际上是按照mRNA的思路来做）是这几年大家还能中标的方向之一，今天我们就来介绍一篇中山大学附属第一医院团队发表在Cell Reports Medicine上的研究，看看具体如何开展：
研究主要揭示了LncRNA H19编码的免疫相关蛋白H19-IRP在胶质母细胞瘤（GBM）免疫抑制性肿瘤微环境（TME）中的作用，并构建了针对H19-IRP的环状RNA疫苗（circH19-vac），展示了其有效的抗肿瘤效果。
研究的作用信号轴：H19-IRP通过直接激活CCL2和Galectin-9的转录，促进髓系来源的抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的招募，导致T细胞耗竭，形成免疫抑制性GBM-TME。
研究团队首先1）通过生物信息学分析和实验验证，确定了H19-IRP在GBM中的表达模式及其与免疫细胞浸润的相关性。接着2）通过体外实验和动物模型，研究了H19-IRP对GBM免疫微环境的影响，特别是对MDSCs和TAMs的招募以及T细胞耗竭的影响。进一步研究团队3）探索了H19-IRP作为TAA（肿瘤相关抗原）的潜力，并开发了circH19-vac疫苗，通过体内外实验评估了其抗肿瘤效果。最后，研究团队还4）探讨了H19-IRP表达的调控机制，特别是缺氧对H19-IRP表达的影响。
下面我们还是通过问题梳理研究思路：
Q1：研究为何选择lncRNA H19及其编码蛋白IRP作为研究对象？
研究选择lncRNA H19及其编码蛋白IRP作为研究对象的原因是H19在多种恶性肿瘤中作为癌基因的角色已被广泛认识，尤其是在胶质母细胞瘤（GBM）中。H19通过与其他mRNAs相互作用的内源性RNA机制调节肿瘤进展的关键基因表达，并能激活关键信号通路促进细胞生存。此外，H19在GBM中的高表达与免疫细胞浸润的特征相关，提示其可能通过编码产物影响GBM的免疫抑制微环境。
Q2：研究是如何通过实验确认lncRNA H19可以编码蛋白IRP的？
研究通过RNC-seq和polysome profiling分析揭示了H19的编码潜力，并发现H19在肿瘤细胞中的表达显著高于神经干细胞。通过生成带有不同FLAG标签的H19构建体并进行免疫印迹分析，研究确认了H19-ORF1能够被翻译成256个氨基酸的蛋白质，即H19-IRP。此外，通过质谱分析在肿瘤细胞中鉴定了H19-IRP的特异性肽段，进一步证实了H19可以编码IRP蛋白。
Q3：研究团队在探索IRP的作用机制时，如何确认对CCL2和Galectin-9的转录调控作用的？
研究团队通过RNA测序分析了敲除H19-IRP的GL261细胞，发现与免疫细胞趋化和IFN-γ反应相关的基因表达发生变化。通过定量PCR和蛋白质芯片分析，研究团队发现CCL2和Galectin-9的表达在H19-IRP缺失的细胞中显著下调。进一步通过荧光素酶报告基因分析、染色质免疫沉淀和电泳迁移率变化分析等技术，研究团队证实了H19-IRP可以直接结合到CCL2和Galectin-9的启动子区域，从而调控它们的转录。
Q4：CCL2和Galectin-9对免疫抑制细胞如MDSC、TAMs等促进T细胞耗竭？
CCL2和Galectin-9在免疫抑制细胞中的作用是通过促进MDSCs和TAMs的招募以及增强T细胞的耗竭来实现的。CCL2作为一种重要的趋化因子，能够吸引MDSCs和TAMs到肿瘤微环境中，而Galectin-9作为TIM-3的配体，能够促进T细胞的耗竭。这些因子的上调有助于形成免疫抑制微环境，从而促进肿瘤的免疫逃逸和进展。
Q5：研究团队如何评价H19-IRP作为TAA（肿瘤相关抗原）的潜力？
研究团队通过分析H19-IRP在临床GBM样本中的表达，并发现其在GBM细胞中的高表达，表明H19-IRP可以作为肿瘤相关抗原（TAA）。此外，通过人类白细胞抗原（HLA）-I免疫沉淀和质谱分析，研究团队鉴定了H19-IRP衍生的能够被CD8+ T细胞识别的肽段，进一步证实了H19-IRP作为TAA的潜力。
Q6：研究团队通过什么方法开发的circH19-vac疫苗，以及如何评估其抗肿瘤效果？
研究团队通过将H19-IRP的开放阅读框架（ORF）插入到含有自切割内含子的环状RNA表达载体中，开发了circH19-vac疫苗。通过脂质纳米颗粒（LNPs）包裹circH19，形成了可用于免疫接种的疫苗。研究团队通过在小鼠模型中评估疫苗的免疫原性和治疗效果，发现接种circH19-vac疫苗的小鼠显示出更强的CD8+ T细胞反应和抑制GBM生长的效果，从而评估了其抗肿瘤效果。
Q7：研究团队如何评估缺氧对H19-IRP表达的影响？
研究团队通过在GBM细胞系中模拟缺氧条件，并检测H19-IRP的表达水平来评估缺氧对H19-IRP表达的影响。使用CoCl2处理细胞或在低氧条件下培养细胞，结果显示H19-IRP的表达增加。此外，通过敲低HIF-1α的表达，研究团队发现H19-IRP的表达受到抑制，表明H19-IRP的表达受到缺氧/HIF-1α轴的调控。
如果大家有基金申请或者课题思路上的疑问，
