今天大号上我们介绍了一下从“小分子药物、代谢物”角度通过与靶基因互作后发挥功能的“套路”，大致分了5个步骤（从重庆医科大学这篇NC看“小分子、代谢物、肠道菌群”要发到10+需要做哪些工作？）。其实这个思路只要大家多看看文献，总结一下就会发现“都差不多”，下面我们换个角度，看看要验证这篇NC研究中的关键发现，需要做到什么样的程度才算严谨。
我们先简单汇总一下这项NC的研究内容：
蜂王浆的成分中链脂肪酸10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）（小分子药物成分）通过靶向天冬酰胺β-羟化酶（ASPH）（关键靶点），调控ERK/p53/p21和GSK3β/p16信号通路（下游信号通路），从而抑制“软骨细胞衰老”（细胞与热点表型）并改善软骨退变和疼痛（临床问题）。
主要的研究内容（简要）
研究团队首先通过体外实验验证了10-HDA对软骨细胞增殖、代谢和衰老的影响，然后利用手术诱导的内侧半月板不稳定（DMM）小鼠模型和自然老化小鼠模型来评估10-HDA的体内效果。
通过DARTS和CETSA技术鉴定了ASPH作为10-HDA的潜在靶点，并进一步通过基因编辑技术（CRISPR-Cas9）构建ASPH基因敲除细胞模型，结合转录组测序分析，揭示了ASPH在软骨细胞衰老中的作用及其调控网络。
最后通过分子生物学和细胞生物学实验验证了10-HDA通过ASPH/ERK/p53/p21和ASPH/GSK3β/p16信号轴抑制软骨细胞衰老的分子机制。
下面我们通过问题来看研究的论证逻辑：
1.为了证明10-HAD抑制软骨细胞衰老并改善软骨退变和疼痛，体现哪些实验设计？
a）在评价10-HAD抑制软骨细胞衰老这个问题时，是否用了多株软骨细胞?
R：是的，研究中使用了来自野生型C57BL/6J 小鼠的原代软骨细胞和人C28/I2软骨细胞系，以评估10-HDA对细胞增殖和代谢的影响。
b）在评价软骨退变和疼痛的动物模型时，是否用了不同的动物模型？
R：研究中使用了手术诱导的内侧半月板不稳定（DMM）小鼠模型和自然老化小鼠模型来评估10-HDA对软骨退变和疼痛的影响。
c）在10-HAD抑制软骨细胞衰老、改善软骨退变和疼痛时，剂量、给药方式和时间点是如何确定的？
R：研究中通过体外实验确定了10-HDA的作用浓度，并在动物模型中通过剂量效应实验确定了有效剂量。给药方式包括关节内注射和口服给药，时间点根据DMM模型的病理进展和自然老化小鼠的生理状态来确定。
d）10-HAD抑制软骨细胞衰老，是否存在剂量依赖效应？
R：是的，研究中观察到10-HDA对软骨细胞增殖和代谢的影响具有剂量依赖性，并且在动物模型中也观察到了剂量依赖的治疗效果。
e）在评价10-HAD抑制软骨细胞衰老时，从细胞形态、细胞功能、通路变化和明星指标上都做了哪些实验？
R：研究中进行了多项实验来评估10-HDA的效果，包括：
细胞形态：使用SA-β-gal染色评估细胞衰老。
细胞功能：通过CCK-8、EdU掺入实验评估细胞增殖，通过Tunel实验评估细胞凋亡。
通路变化：通过qPCR和Western blot分析了ERK/p53/p21和GSK3β/p16信号通路的变化。
明星指标：检测了p16、p21等衰老标志物的表达。
f）为了排除非特异性作用或者其它干扰因素，除了对照与10-HAD处理外，还有哪些分组？
R：研究中设置了多个对照组，包括PBS对照组、IL-1β处理组以及不同浓度的10-HDA处理组，以排除非特异性作用。此外，还使用了ASPH基因敲除细胞模型和过表达模型来进一步验证10-HDA的作用是否依赖于ASPH。
2.研究发现10-HAD通过直接靶向天冬酰胺β-羟化酶（ASPH）抑制软骨细胞衰老，实验设计上，如何体现出ASPH在10-HAD抑制抑制软骨细胞衰老中的关键必要作用？
R：
1）药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）实验：通过DARTS实验，研究者发现10-HDA能够保护一个分子量在50-75 kDa的蛋白质不被蛋白酶降解，后续质谱分析鉴定这个蛋白质为ASPH，从而揭示了ASPH可能是10-HDA的直接作用靶点。
2）细胞热位移分析（CETSA）：通过CETSA实验，研究者发现10-HDA能够增强ASPH蛋白的热稳定性，进一步证实了10-HDA与ASPH之间的直接相互作用。
3）ASPH基因敲除（KO）细胞模型：研究者利用CRISPR-Cas9技术构建了ASPH基因敲除的C28/I2细胞模型，以评估ASPH在10-HDA调控软骨细胞代谢中的作用。在ASPH-KO细胞中，10-HDA对软骨细胞代谢的调控作用减弱或消失，如COL2的激活和MMP13的抑制受到影响，这表明ASPH对于10-HDA的效应是必要的。
4）ASPH过表达细胞模型：研究者还在ASPH-KO细胞中重新表达了含有10-HDA结合位点的ASPH突变体（Δ2），发现这可以恢复10-HDA对软骨细胞代谢的调控作用，从而证实ASPH的特定结构域对10-HDA的作用至关重要。
5）信号通路分析：通过Western blot和qPCR等技术，研究者检测了10-HDA对ASPH-KO细胞中ERK/p53/p21和GSK3β/p16信号通路的影响，发现10-HDA通过ASPH调节这些信号通路，进而影响软骨细胞的衰老。
好，内容我们先说到这里。
如果大家有基金申请或者课题思路上的疑问，
