由于国自然项目越来越强调“聚焦科学问题”，而像肺癌这种“很泛”的疾病就要有具体的切入点，即不能直接用一个“肺癌”来泛指所有的临床情况，因此就需要加上“定语”，比如P53突变的肺癌、肥胖相关肺癌、小细胞肺癌等等，同样的道理也适用于非肿瘤疾病的研究。所以今天我们就选了一篇发表在Nature Communications期刊上的研究说明这个问题：
研究主要关注烟草诱导的高血糖通过改变巨噬细胞的代谢重编程，促进肺癌进展的作用机制。研究发现：烟草成分NNK和BaP（后续用NB缩写代指）诱导的高血糖增加了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的葡萄糖摄取，激活“IGF2/IR/ NPM1/ PD-L1”信号轴，进而促进肺癌细胞的免疫逃逸和肿瘤进展（具体机制）。
下面我们通过问题来看一下研究内容：
1.研究的临床问题是什么？
R：研究的临床问题是探讨吸烟如何通过代谢综合征促进肺癌的进展。具体来说，研究试图建立吸烟引起的代谢综合征与肺癌发展之间的直接联系，并探索这一过程中潜在的分子和细胞靶点，以抑制吸烟介导的肺癌进展。
2.烟草如何诱导高血糖？
R：烟草诱导高血糖的机制大约包括几种：损害胰岛β细胞的功能、激活氧化应激诱导胰岛素抵抗、改变葡萄糖代谢、促进胰高血糖素释放增加血糖水平和减少胰岛素分泌等方式。
3.烟草和高血糖如何影响TAMs的代谢状态？
R：NB暴露增加了TAMs中GLUT1和GLUT3的表达，导致更多的葡萄糖被TAMs摄取，显示出更高的氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），表明它们的代谢活动增强，尤其是糖酵解和氧化磷酸化的增加，这种代谢重编程使得TAMs倾向于表现出M2型表型。
4. TAM的代谢改变如何影响IGF2/IR/NPM1/ PD-L1信号轴？
R：TAMs的代谢改变通过增加IGF2的产生，以旁分泌的方式激活肺癌细胞胰岛素受体IR，导致IR的核转位和与转录共激活因子NPM1的结合，进一步与RNA聚合酶II和组蛋白相互作用，增强了PD-L1基因启动子的活性，导致PD-L1的转录激活，进而激活CD274（PD-L1）基因的表达。IGF2/IR/NPM1/PD-L1信号轴的激活为肺癌细胞提供了干细胞特性和免疫逃逸特性，促进了肺癌的进展和转移。
5.为了证明“NB增加巨噬细胞对葡萄糖利用进而促进IGF2转录”，研究团队做了哪些实验，让逻辑严密？
R：首先使用PET/MRI技术对NB暴露小鼠的肺部进行了18F-FDG的摄取分析，以定量评估葡萄糖摄取的增加；其次通过LC/MS代谢组学方法分析了肺部代谢物的变化，Seahorse分析评估NB暴露对巨噬细胞糖酵解和氧化通量的影响；然后，通过直接测量THP-1细胞对2-NBDG的摄取以及OCR和ECAR的变化。最后，利用免疫荧光和流式细胞分选技术，进一步分析葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT3在肺巨噬细胞中的表达和定位情况。
6.为了证明“巨噬细胞IGF2激活肿瘤细胞中的胰岛素受体（IR），促使IR核转位，并与核磷蛋白NPM1等在PD-L1基因启动子结合从而上调PD-L1的表达”，研究团队做了哪些实验，让逻辑严密？
R：
1）研究IR的核转位
首先使用Western blot和免疫荧光检测IGF2刺激后IR在细胞核中的水平，以确认IR的核转位。接着，通过免疫共沉淀（Co-IP）技术分析IR与KPNB1和KPNA2之间的相互作用，这两个蛋白是IR核转位所必需的。
2）研究IR与NPM1等蛋白结合
进一步利用LC-MS/MS技术鉴定了IGF2刺激后与IR相关的核蛋白。此外通过Co-IP分析IR与NPM1、组蛋白和RNA聚合酶II之间的相互作用。
3）研究IR与NPM1对PDL1的转录激活
为了直接证明IR和NPM1在PD-L1基因表达中的调控作用，他们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）分析，以检测IR和NPM1与PD-L1启动子的结合情况。最后通过荧光素酶报告基因实验，他们评估了PD-L1启动子的活性变化，从而证实了IGF2诱导的IR信号轴如何通过NPM1促进PD-L1的表达。
7.这项研究中，做了哪些实验证明巨噬细胞-IGF2与肿瘤细胞胰岛素受体（IR）作用？
R：首先利用THP-1细胞和BMDMs的条件培养基（CM）处理肺癌细胞株A549和LLC，并通过分析IR的磷酸化水平来评估IR的活性变化；接着通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，他们成功构建了IGF2表达被敲除的THP-1和BMDMs细胞系，并进一步评估了这些细胞CM对肺癌细胞克隆形成和球形成能力的影响。此外使用IR特异性shRNA敲低肺癌细胞中的IR表达，并评估了CM对这些细胞克隆形成和球形成能力的影响，从而揭示IR在肺癌细胞中的功能。最后，为了在体内验证这些体外实验结果，研究团队在动物模型中将LLC细胞与NB预处理的BMDMs共注射，以评估肿瘤生长和肺转移的情况。
最后是研究的“假说图”
烟草成分NNK和BaP（NB）增加了巨噬细胞对葡萄糖的利用，这一过程涉及到葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT3的转录和膜定位上调，进而导致巨噬细胞中IGF2的转录增加。巨噬细胞产生的IGF2以旁分泌的方式激活肿瘤细胞中的胰岛素受体（IR），促使IR核转位并与核磷蛋白NPM1以及RNA聚合酶II在PD-L1基因的启动子区域形成复合物，从而上调PD-L1的表达。这种PD-L1的表达增加赋予肿瘤细胞干细胞特性和免疫逃逸能力，最终导致肿瘤的侵袭性和转移性的增强。
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